и микроорганизмов, для которой характерна очень большая разрешающая способность генетического анализа. В этих работах понятия о единице мутации, единице рекомбинации и единице генетической функции были четко разграничены. Генетические исследования, «расщепившие» ген на субъединицы, начались примерно в то же время, когда Уотсон и Крик предложили свою модель структуры ДНК. Благодаря изучению тонкой структуры гена была заполнена брешь в представлениях о генетической карте и физической структуре молекулы ДНК. Эти исследования опровергли теорию неделимого гена

и привели к концепции гена как последовательности нуклеотидных пар в молекуле ДНК. Они революционизировали генетику также, как революционизировало физику открытие делимости атома в конце прошлого века.

Бактериофаг как генетическая система

Практически все генетические эксперименты с фагами выполняются без непосредственного наблюдения над родителями и потомством. Для определения фенотипов изучаемых генетических вариантов используют косвенные методы. Как уже говорилось в гл. 4, присутствие фагов обычно устанавливают по их способности убивать заражаемые ими бактерии. О присутствии фагов свидетельствуют стерильные пятна (их называют также негативными колониями или бляшками) в сплошном слое бактериальных клеток на поверхности чашки Петри (рис. 6.1). Видимое на поверхности чашки прозрачное пятно - результат гибели бактериальных клеток-хозяев, зараженных потомством этого фага. Следовательно, прежде чем рассматривать генетику фагов, нам надо познакомиться с методами описания фенотипов мутантных фагов. Более углубленно генетика фагов будет рассмотрена в следующей главе.

Рис. 6.1. Бактериальный газон Е, coli В с негативными колониями (бляшками) фагов Т4г+ и Т4гП. «Крапчатые» бляшки возникают в результате присутствия обоих генотипов. (Stent G. S., Calendar R. 1978. Molecular Genetics, 2nd ed., W. H. Freeman, San Francisco.) [Имеется перевод: Стент Г., Кэ-линдар Р. 1981. Молекулярная генетика, М., Мир.]

Проще всего наблюдать мутации, влияющие на морфологию негативных колоний. Некоторые мутации влияют на их размер. Другие мутации могут давать либо прозрачные, либо мутные бляшки (последнее является следствием того, что от инфекции погибают не все клетки). Такие фаги, как Т2, Т4 и фХ174, убивающие все инфицированные клетки и соответственно дающие прозрачные негативные колонии, называются вирулентными фагами. Фаги лямбда и Р1 не всегда убивают клетку-хозяина; стерильные пятна, образуемые ими, бывают мутными, а сами фаги называются умеренными; они могут существовать внутри бактерии-хозяина в качестве профага, не вызывая ее лизис.

Фаги, заражая бактериальные клетки, прежде всего прикрепляются к специальным рецепторам на поверхности клеток. Природа этих рецепторов генетически контролируется клеткой, и можно выделить му-тантные штаммы бактерий, у которых рецептор видоизменен таким образом, что фаг адсорбироваться не может. Мутации фага, дающие ему возможность прикрепляться к бактериям, к которым фаг дикого типа прикрепиться не может, позволяют выделить гены, ответственные за адсорбцию. Мутации, изменяющие морфологию негативных колоний, и мутации, влияющие на адсорбцию фага, исследовались в числе первых; однако они составляют лишь небольшую часть генома фага.

Большая часть фаговых генов контролирует функции, наобходимые для репликации и производства потомства. Мутации этих генов препятствуют появлению потомства и, следовательно, летальны-негативных колоний не образуется вовсе. Летальные мутации фагов, если не считать некоторых специальных обстоятельств, не могут широко распространяться подобно рецессивным леталям у многих эукариот, поскольку фаги гаплоидны. Условно летальными мутациями называются мутации, летальные при одних условиях (называемых непермиссивными или ре-стриктивными) и не влияющие на размножение фагов в других условиях (пермиссивных). Эти мутации позволяют идентифицировать и изучать большую часть генов фага. Первыми условно летальными мутациями, изученными в генетике фагов, были гЛ-мутации фага Т4.

Система /__"бактериофага Т4

Классический анализ тонкой структуры гена был проведен Сеймуром Бензером на гЛ-мутантах фага Т4 в 50-х годах. Бензер использовал два селективных преимущества этих мутантов.

Во-первых, r-7-мутанты можно отобрать в большом количестве, поскольку при посеве на Е. coli В их негативные колонии имеют очень характерную морфологию. Эти мутанты вызывают быстрый лизис кле-ток-хозяина, в результате чего их негативные колонии получаются намного крупнее, чем при заражении фагом дикого типа (рис. 6.1). На чашке Петри одна-единственная бляшка rll легко может быть выделена из 2000 бляшек типа rll +. Использование химических мутагенов сильно повышает частоту мутаций rll по сравнению со спонтанной; соответственно независимо могут быть выделены сотни мутантов rll.

Во-вторых, Бензер обнаружил, что г//-мутанты не дают потомства, когда они инфицируют клетки Е. coli К (К), содержащие профаг X. rll-мутанты прикрепляются к таким клеткам и вводят в них свою ДНК, но инфицированные клетки погибают, не продуцируя фагового потомства.

Таблица 6.1. Морфология негативных колоний фага Т4 дикого типа и rll-му-тантов

Фенотипы при посеве на:

Фаг

Т4гЯ+

Т4гЛ

Е. coli В Мелкие бляшки Крупные бляшки

Е. coli К (к) Мелкие бляшки Бляшки отсутствуют (деталь)

Рис. 6.2. Схема скрещивания двух мутантных фагов, А и В. Скрещивание осуществляют путем совместного заражения бактерии-хозяина в пермиссивных условиях.

АВ* АВ А*В А*В*

риофагов. Клетки пермиссивного хозяина (штамма В) заражают двумя мутантами, затем подсчитывают общее число потомков при высеве на клетки штамма В и число rll+ -рекомбинантов. Для этого в качестве хозяина используют штамм К (А.). Так как реципрокные рекомбинанты, т. е. двойные мутанты rll, при этом не выделяются, то считают, что частота их появления совпадает с частотой рекомбинантов дикого типа. Поэтому при расчете расстояния на генетической карте число рекомбинантов дикого типа умножается на два:

2 • Число потомков типа rll+

Генетическое расстояние = 100 (6.1).

Общее число потомков

Природа мутаций в области гП

В модели структуры ДНК Уотсона и Крика предполагается, что замена одной нуклеотидной пары в нормальной нуклеотидной последовательности гена может привести к формированию мутантного фенотипа. Можно предположить, что мутация, в основе которой лежит замена одной нуклеотидной пары, должна обладать следующими свойствами: 1) обратные мутации, переводящие мутантный фенотип в нормальный, должны происходить примерно с той же частотой, что и прямые; 2) ей должна соответствовать определенная точка на генетической карте; 3) такая мутация должна обладать способностью к рекомбинации с любыми другими точечными мутациями, за исключением тех, которые представляют собой независимые замены той же нуклеотидной пары. Некоторые из изученных Бензером г/7-мутантов обладали перечисленными свойствами, другие-нет. Данные, представленные в табл. 6.2, показывают, что частота обратных мутаций к дикому типу у различных rll-мутантов, способных к рекомбинации друг с другом, сильно различается. Некоторые из г//-мутантов вполне стабильны и не ревертируют к дикому типу (т.е. не дают бляшек на Е. coli К (А.)); другие ревертируют к дикому типу с измеримыми и характерными частотами. Генетическая карта г/7-мутантов, представленных в табл. 6.2, изображена на рис. 6.3.

Результаты рекомбинациснного анализа более широкого набора из 60 независимо полученных г/7-мутантов представлены на карте

Рис. 6.3. Генетическая карта /-//-мутаций фага Т4, приведенных в табл. 6.2. Цифры над стрелками указывают расстояния. [Benzer S. (1955). Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 41, 344.]

1 единица карты <-— >

г51 г102

I Н1Ш1М11

Л цистрон—^-B цистрон r47 rI04 rlOl rlOJ rI05 r706

возникающих при попарных скрещиваниях между мутантами. {Benzer S. (1955). Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 41, 344.]

шшГнпшшйнии Г II

Рис. 6.4. Карта тонкой структуры нескольких участков области rll фага Т4. Числа между стрелками на картах участков а, Ь, с и d означают процент рекомбинантов дикого типа,

(рис. 6.4). Тщательное изучение этой карты показывает, что некоторые из Г-7-мутантов (а именно не ревертирующие к дикому типу) рекомби-нируют, давая rll+ потомство не со всеми остальными r/7-мутантами, но лишь с некоторыми из них. Соответственно эти мутации занимают на генетической карте участки большие, чем точечные мутации (размер участка зависит от конкретной мутации), и изображены жирными черными линиями, перекрывающими на карте мутации, с которыми они не рекомбинируют. Например, рассмотрим карту области а на рис. 6.4. Мутант 168 рекомбинирует с мутантами 295 и 312, но ни один из этих трех мутантов не дает рекомбинантов дикого типа с мутантом 47. Все эти четыре мутанта рекомбинируют с мутантами 145, 282 и 22с?. Если мутанты 168 и 295-это точечные мутации, то мутант 47 должен возникать в результате изменения более чем одной точки на генетической карте (т.е. изменения более чем одной нуклеотидной пары).

Относительно мутантов типа 47 было показано, что они представляют собой делеции многих последовательных пар нуклеотидов. Исследование рекомбинации двойных г//-мутантов показало, что такие мутации как бы вырезают из генетической карты участки, расположенные между фланкирующими генетическими маркерами, это неудивительно, поскольку у таких мутантов физически отсутствует участок ДНК между этими маркерами (рис. 6.5).

Из этих исследований был сделан важный вывод: фенотипически неразличимые г77-мутации могут быть следствием либо замены отдельной нуклеотидной пары, либо делеции некоторого числа пар нуклеотидов. Свойства, обнаруживаемые у таких делеции, нельзя считать неожиданными. Действительно, вряд ли утрата некоторого числа нуклеотидных пар может быть обратимым процессом, поскольку при этом должны восстанавливаться точное число и последовательность этих пар. Аналогично скрещивание между носителем такой делеции и штаммом с точечной мутацией, расположенной в участке