опадающий в дочерние клетки. При этом многие гены фага, потенциально летальные для клетки-хозяина, находятся в неактивном состоянии, или репрессированы. Однако иногда фаг может индуцироваться, переводя клетку на путь лизиса; клетка погибает, высвобождая многочисленное потомство фага (рис. 7.6). Таким образом, фаг X служит моделью генетической системы вирус-хозяин. Изучение его функционирования послужило основой для современных представлений об опухолеродных вирусах млекопитающих, способных встраиваться в геном, таких как вирус полиомы и SV40. В этой главе мы рассмотрим различные типы

, атЗЗ ат50 tsl2l> \ ш t

ts4 ат80&

amNlf' am23 J

А

Репликация RF-ДНК

>?« am 30 V» am 35 • amir?

am90

Шипы отростка

am 32 ф

ts79*.

ts8 * am 9 •

G Шипы отростка

Структурные, репликация SS-ДНК

Репликация SS-ДНК

Репликация SS-ДНК Д

В

• am/-/

ioch6

4amHSl Jam 10

ат89жат87* ат88

*/

атН57 i

Лизис

Е

\?атЗ

\

tsh6

Ьр6ор9 ?

Рис. 7.5. Генетическая карта фага фХ174. Схематически изображены частоты появления рекомбинантов дикого типа при двухфакторных скрещиваниях. Расстояния между черточками соответствуют частоте появления рекомбинантов дикого типа, равной 10 "4. Внутри цистрона А черточки вне круга соответствуют частотам рекомбинации сайтов внутри

цистрона А с маркерами в других цистронах; черточки, ориентированные внутрь круга, соответствуют частотам рекомбинаций внутри цистрона А. Границы между цистрона-ми (цветные черточки) проведены условно. Указаны функции каждого цистрона. [Benbow R.M. et al. (1974). J. Virol., 13, 898.]

мутаций, обнаруженные у фага X, а также генетическую и физическую карты его генома. Экспрессия и регуляция генома фага X будут подробно рассмотрены в гл. 15.

Гены фага к

Для идентификации мутантов фага X, так же как и других бактериофагов, анализируют негативные колонии (бляшки). Гены фага X можно разбить на две группы: существенные для формирования негативных колоний (обозначаются прописными буквами) и несущественные (обозначаются строчными буквами или буквами греческого алфавита). Существенные гены идентифицируются с помощью условно летальных мутаций: либо sus, либо ts, как уже обсуждалось выше. Комплемента

ционный анализ этих мутаций показал, что они локализованы в 25 различных цистрон ах. Семь цистронов отвечают за формирование нормальной головки фага, семь других-за формирование нормального хвостового отростка. Эти гены либо кодируют структурные белки, входящие в состав фага, либо необходимы для правильной сборки фаговых частиц. Два гена обеспечивают лизис клетки и высвобождение потомства фага. Еще два гена необходимы для репликации ДНК фага X, остальные три гена играют важную регуляторную роль.

Несущественные гены идентифицируются по морфологии негативных колоний или при делециях участков генома, в которых они локализованы. Фаги X дикого типа при посеве на восприимчивого хозяина образуют мутные негативные колонии, поскольку некоторые из инфицированных клеток становятся лизогенными. Клетки, содержащие профаг X, иммунны по отношению к заражению фагом X и поэтому размножаются внутри негативной колонии, делая ее мутной. Некоторые мутации (clear, с) придают фагу способность формировать прозрачные бляшки. Эти мутанты не способны к лизогенизации, и инфицированная ими клетка всегда разрушается. Мутации clear обнаружены в четырех раз90

100%

Л W BCDEFZUVGT HMLK 1 ]

m5 h

M A W В С DE FZUVGT HML К 1

в r

Г -—L —

IN CCM rt^

J—I_A^-I—bZ-ЫI LIS P INT I EXO I У

rex cro clH N I d\dlOP

«K , CRO DL

Q S R

Q SR

ДЬ53в--Ы21Рис. 7.7. Геном фага X. Гены, существенные для развития фага, обозначены строчными буквами. А. Процентная шкала расстояний вдоль молекулы ДНК. Б. Генетическая карта, построенная на основании частот рекомбинации. В. Физическая карта, основанная на гетероду-плексном анализе. Г. Некоторые из перестроек, использованные при гетеродуплексном картировании: GAL и ЫО~замещения, fe-делеции и замены, влияющие на иммунные свойства фагов лямбдоидного семейства. Д. Распределение генетических функций в геноме.

личных генах: cl, ell, сШ и су. Другие несущественные гены идентифицируются по мутантным фагам, которые имеют крупную делецию, но тем не менее способны формировать негативные колонии. Делеций в фаге X обнаружить легко, поскольку несущие делеций фаги содержат в головке меньше ДНК по сравнению с нормальными, а следовательно, их ДНК характеризуются иной плотностью, что выявляется при центрифугировании в градиенте хлористого цезия. Такие мутации с измененной плотностью ДНК обозначаются буквой Ъ. Фаговая частица может утратить до 22% ДНК из середины молекулы, не утрачивая способности формировать негативные колонии. Однако фаги с такими делециями не способны к лизогении или генетической рекомбинации, поскольку у них все же нарушены некоторые функции.

На рис. 7.7 изображена генетическая карта, построенная по данным о частоте рекомбинаций между мутациями, затрагивающими размножение фагов. Замечательная особенность этой карты в том, что гены, ответственные за осуществление родственных физиологических функций, сгруппированы вместе (гены формирования головки, формирования хвостового отростка, гены, ответственные за лизис). Другая важная особенность генетической карты фага Х-это ее линейность: выделенная из фаговых частиц X ДНК имеет форму линейных двухцепочечных молекул.

Профаг X

Мутантные гены, содержащиеся в профаге X и встроенные в бактериальный геном, можно картировать, используя описанные в следующих главах методы генетики бактерий. Такие исследования показали, что профаг X встраивается в геном Е. coli между генами gal и Ыо, контролирующими потребление сахара галактозы и синтез витамина биотина соответственно. Последовательность генов на генетической карте профага сравнивали с соответствующей последовательностью на генетической карте фага (рис. 7.8). Они, как ни странно, не тождественны: любая из них получается из другой посредством циклической перестановки. Это различие в последовательности генов возникает из-за механизма, с помощью которого Х-ДНК встраивается в бактериальную хромосому.

Линейная молекула ДНК фага X имеет комплементарные одноцепо-чечные концы, состоящие из 12 нуклеотидов. После проникновения в клетку бактерии-хозяина эти «липкие» концы сшиваются ДНК-лига-зой и образуется кольцевая молекула. Кольцевая молекула ДНК фага X может затем встроиться в бактериальную хромосому при участии фагового гена int, кодирующего белок, который катализирует сайт-специфическую рекомбинацию между участком прикрепления ДНК фага к хромосоме бактерии (attP) и соответствующим бактериальным сайтом (attB или attX). При этом хромосома X разрывается в attP-сайте, который локализован в середине генетической карты фага, и в результате происходит изменение последовательности генов в профаге, как это показано на рис. 7.8.

После внедрения в бактериальную хромосому все гены X, кроме двух, перестают работать (инактивируются) и оказываются под контроРис. 7.8. Карты вирулентного фага и про-фага X: показаны механизм интеграции кольцевого генома X в хромосому хозяина. Сайт attP обозначен символом POP', а сайт attB- символом ВОВ'.

ДНК фага X

POP' N<з>—

т, т -липкие концы

gal ВОР' N Rm'mA

Интегрированная ДНК профага X

} РОВ' Ыо

дем репрессора- бедка, кодируемого геном cl. Наличие репрессора создает у Е. coli (X) иммунитет к инфицированию другими фагами X. Про-фаг X реплицируется как часть родительской хромосомы и наследуется дочерними клетками. В популяции лизогенных бактерий примерно 1 из 106 клеток в каждом поколении вследствие спонтанной индукции профага лизируется и освобождает многочисленное потомство фагов X (рис. 7.6). Такая способность бактериальной культуры с профагом спонтанно продуцировать фаг объясняет происхождение термина лизо-гения. Причины спонтанной индукции не ясны, однако известно, что нарушение способности клетки-хозяина реплицировать собственную ДНК может вызвать индукцию. Так, например, ультрафиолетовое облучение индуцирует большинство содержащих профаг клеток культуры. Описаны температурочувствительные мутации с/-гена, вызывающие индукцию при повышенной температуре. Эти мутации дают удобный экспериментальный метод изучения последовательных этапов индукции. Первое событие, связанное с индукцией,- выход профага из хромосомы. Механизм этого процесса аналогичен механизму включения профага. Выход из хромосомы контролируется двумя генами фага X, int и xis; результатом является образование кольцевого генома X, который начинает реплицироваться посредством 9-механизма и продуцирует множество дочерних геномов. Впоследствии механизм репликации ДНК меняется на ст-тип. Образующиеся при этом линейные геномы фага инкапсулируются в белковую головку (см. гл. 4).

Профаг X почти всегда вырезается из хромосомы бактерии точно по своим границам, образуя кольцевую форму интактного генома X. Иногда, однако, вырезание происходит неточно, что приводит к образованию кольцевой молекулы ДНК, в которой один из концевых участков генома профага утрачен, а вместо него включен участок хромосомы Е. coli, смежный с другим концом генома профага (рис. 7.9). Такие гибридные молекулы могут продуцировать новые жизнеспособные фа

говые частицы лишь в том случае, если не утрачены какие-либо существенные гены генома X. Те молекулы, в которые попадает ген bio Е, coli (X bio), жизнеспособны, так как в них обычно отсутствуют лишь несущественные гены между attP и геном N. Напротив, молекулы, в которые попадает ген gal Е. coli обычно неполноценны в результате утраты существенных генов, локализованных между attP и левым концом хромосомы. Если какие-либо существенные гены утрачены и фаг не способен формировать негативные колонии, его называют дефектным и в название такого фага вносится буква d: Xdgal. Фаги Xdgal или Xdbio (в случае, если утрачен существенный ген N) способны размножаться в присутствии нормального фага X, компенсирующего функции, нарушенные у этих фагов. Фаги Xdgal и Xdbio легко выявить благодаря их сп