Биологический каталог




Современная генетика. Том 1

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

особности трансдуцировать гены gal+ и Ыо+ в даГ- или Ыо~~ бактерии. Эти трансдуцирующие фаги также могут лизогенизировать клетки Е. coli (Xdgal).

Размер замещенного участка в геноме X конкретных фаговых штаммов Xdgal или Xbio можно оценить с помощью комплементационного и рекомбинационного тестов. Например, фаг Xdgal можно испытывать на способность либо образовывать рекомбинанты дикого типа в скрещиваниях со множеством различных мутантных линий фага, либо компле-ментировать с известными мутантами при смешанном инфицировании. В табл. 7.5 представлены данные о наличии или отсутствии рекомбинантов дикого типа при скрещивании нескольких фагов Xdgal с носителями определенных sws-мутаций в различных цистронах. Если в данном штамме Xdgal отсутствует соответствующий ген дикого типа, то рекомбинанты дикого типа не образуются. Эти данные позволяют определить положение левого конца, встроенного в геном X участка гена gal относительно мутаций sus на генетической карте, как это изображено на

рис. 7.10. Правый конец этого участка всегда совпадает с сайтом интеграции attP.

После того как получен набор Xdgal фагов с картированными левыми концами, уже легко оказывается определить положение неизвестных точечных мутаций относительно этих концов: требуется лишь узнать, образуются ли рекомбинанты дикого типа между неизвестным мутантом и фагом соответствующей линии Xdgal. Эта методика аналогична методике картирования r/7-мутаций с помощью делеции (см. гл. 6).

Сопоставление генетической и физической карт фага X

Данные электронной микроскопии позволяют установить точное соответствие между генетической картой фага X, построенной на основе данных о рекомбинации, и молекулой ДНК, представляющей собой хромосому фага X. Для решения этой задачи используют делеции [ХЬ)

\ 1 1 1 1 1 н 1—

А В Ы G Н М attP

Xdgal 1 Xdgal 2 Xdgal 3 Xdgal 4 Xdgal 5

Рис. 7.10. Локализация конечных то- в скрещиваниях между штаммами

чек giaZ-замещений на генетической Xdgal с известными sMS-мутантами.

карте фага X производится по нали- Изображенная карта построена по

чию рекомбинантов дикого типа данным таблицы 7.5.

Цепи ДНК

(w/c) А

(++/++)—

J ь?

Генотип

{b2b5imm2x jb2b5immn )

\Ъ2Ь5 imm21

Ь?

imm^b5*

(+ +/b2bJimm2i)Z

imm*

JL г

\b2b5imm21

Рис. 7.11. Схема образования гетеродуплекса между одноцепочечными молекулами ДНК, исходно входившими в состав двухцепо-чечных молекул, различающихся между собой делециями и перестройками. Геном, в котором участок imm21 заменен на imm1, короче генома фага X дикого типа; такая перестройка называется делецией Ь5.

и замещения (Xdgal, ХЫо), описанные в предыдущем разделе. Кроме того, оказываются полезными близкородственные «лямбдоидные» фаги (фаги 434, 82, 21), геном которых содержит некоторые гены, общие с фагом X, а также негомологичные фагу X области. Каждый член семейства лямбдоидных фагов синтезирует характерный лишь для него уникальный репрессор, и, следовательно, ответственные за иммунитет участки генома (imm) у них также уникальны. Другими словами, области иммунитета в разных лямбдоидных фагах негомологичны. На рис. 7.11 схематически представлено образование гетеродуплексных молекул ДНК, в которых каждая комплементарная цепь имеет свое генетическое происхождение. Электронно-микроскопическое исследование таких гетеродуплексных молекул позволяет идентифицировать комплементарные и некомплементарные области (рис. 7.12). Более точно можно сказать, что хорошо воспроизводимые измерения протяженности двухцепо-чечных участков таких гетеродуплексных молекул ДНК позволяют установить положение концевых точек делеций и добавок в таких молекулах. Соответствие между этими концевыми точками в молекуле ДНК и концами соответствующих перестроек на генетической карте можно установить, получая гетеродуплексы из одноцепочечных молекул^

Рис. 7.12. Электронная микрофотография гете-родуплекса Xgal/X. А. Препарат гетероду-плекса Xdgal Р1Ъ/ХЬ5. Одноцепочечные участки на фотографии испещрены кружочками (обозначение Ь5 объяснено в подписи к предыдущему рисунку). Б. Препарат гете-родуплекса Xdgal Р74/Х+, на котором отчетливо видны одно-цепочечные участки. Измерение длины двухцепочечных участков дает оценку физического расстояния от концов делеции до концов молекулы. Присутствие делеции Ь5 на микрофотографии А показывает, что правый конец изображенной здесь молекулы соответствует правому концу генетической карты, поскольку Ь5 расположена справа от gal. [Davis R. W., Parkinson J. S. (1971). J. Mol. Biol., 56, 403.]

as

. ., • • •. • , • ? . . ..ДНК с известными генетически картированными делениями и добавками (рис. 7.11). Такой гетеродуплексный анализ позволяет построить физическую карту параллельно с генетической картой на рис. 7.7. Поскольку известна общая длина молекулы ДНК X (она составляет около 49 ООО н. п.), можно определить примерную величину каждого гена.

Организация генома фагов Т2 и Т4

Крупные фаги Т2 и Т4 близкородственны. Они обладают идентичной организацией генома, и большинство генов у них общие. Радиоавтография хромосомы фага Т4 (рис. 7.13) свидетельствует о линейности молекулы ДНК. Ее мол. масса равна 120-106 дальтон, а длина составляет 182 ООО пары нуклеотидов. Фаг Т4 был предметом интенсивных генетиРис. 7.13. Радиоавтограф хромосом фага ^ . * -*.-. Д ***,V

Т2. Каждая молекула Л * V' '???^?:'>?, , *

содержит полный ге- *\;у% :л::.:Т/о.:.':^Л . v: , *

ном бактериального # ,

вируса и имеет протя- * женность 52 мкм (Dr. '? ' *

Jo/in Cairns, Imperial * ^ * *v * : i* .:

Cancer Research Fund, * *

ческих исследований (вспомните гЯ-мутанты из гл. 6), и для него известны мутации во многих цистронах. Анализ рекомбинации с использованием трех- и четырехфакторных скрещиваний показал, что генетическая карта фага Т4 имеет кольцевую форму (рис. 7.14). Противоречие между линейностью молекулы ДНК фага и кольцевой формой его генетической карты удалось разрешить в результате генетических и физических экспериментов, показавших, что выделенные из фага Т2 линейные молекулы ДНК содержат на обоих концах участки с одинаковыми последовательностями нуклеотидов (концевую избыточность), а порядок генов в молекуле допускает циклические перестановки. Физические данные о концевой избыточности (дуплицированности) последовательностей оснований получены из экспериментов, в которых ДНК Т2 подвергалась действию экзонуклеазы III. Этот фермент последовательно отщепляет нуклеотиды с 3-ОН-концов цепей ДНК, в результате чего на концах двухцепочечной молекулы образуются одноцепочечные участки с 5'-Р04-концами (рис. 7.15). Инкубация этих подвергнутых действию фермента молекул в условиях, допускающих установление водородных связей между комплементарными одноцепочечными последовательноРис. 7.15. Схема, демонстрирующая концевую избыточность в геноме фага Т2 и образование кольцевой молекулы ДНК. Каждую из трех молекул можно превратить в любую другую путем циклической перестановки, и оба конца каждой молекулы содержат концевые повторы. Экзонуклеаза III действует на 5'-концы (место действия фермента указано стрелкой), и образовавшиеся комплементарные участки «склеиваются», образуя кольцевые молекулы. Если длина отрезанных концов превышает длину повторяющихся участков, то в кольцевой молекуле дуплексный сегмент оказывается обрамленным двумя одноцепочечными участками (брешами). Длина двухцепочечного сегмента (и его состав) совпадает с длиной концевых повторов (см. рис. 7.16).

Z' У 4' 5' 6' 7' 8' 9' О' V 2'

34567890 1 234

3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' (У V 2' 3' 4'

567890123456

3 4

5' 6' 7' 8' 9' 0' 1' 2' 3' 4' 5' 6' Экзонуклеаза III

9 0

3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' 0' 1' 2' 3456789012

6' 7' 8' 9' О' Г 2' 3' 4' 67890123

8' 9' 0' 1' 2' 3' 4' 5' 6'

Образование кольца

"З 4 5 6

стями, приводит к образованию кольцевых молекул (рис. 7.16). Замыкание в кольцо возможно лишь в том случае, если двухцепочечная молекула ДНК фага Т2 содержит идентичные последовательности оснований на обоих концах, как это схематически изображено на рис. 7.15. Прежде чем молекулы становятся способны образовывать кольца, фермент должен отщепить около 2% ДНК Т2. Это означает, что протяженность дуплицированных (избыточных) концов молекулы составляет около 1% длины генома.

Генетические данные о концевой избыточности геномов фагов Т2 и Т4 проистекают из существования гетерозиготных фаговых частиц. Фаговые гетерозиготы возникают в результате рекомбинации между фагами с различными генотипами. Они легко идентифицируются, поскольку каждый такой фаг образует негативную колонию, содержащую фаги обоих генотипов (см. рис, 6.1). Геном единичного фага может быть

Рис. 7.16. Электронная микрофотография кольцевых молекул ДНК фага Т2. А.

Кольцевая молекула •

протяженностью 54,9. 1

Б. Кольцевая молеку- k • - - ,-\ у\ rf<

ла, на которой видны

два близко располо- - ,«"J,4-'»'X*?''**

женных одноцепочечных участка, разделенные дуплексным " ' * »*1 7 •?

сегментом длиной | Jj&X&ffi

1,7 мкм (см. стрелки). —. 1 } ,j„^\

Этот дуплексный сег- . ^^SlJ^^sV^ f

мент соответствует

концевой избыточности , - .ТыГ/. \ , I/, /\

молекулы. [Mac Hattie . "* '~Z*syH. '^'^V

L. A et al. (1967). J. Л»<3&? ^\"' ~ *

Mol. Biol., 23, 355.] " * Jf*'* \

гетерозиготаым лишь по тесно сцепленным генам. В популяции фагов, однако, встречаются гетерозиготы по всем генам, безотносительно к их положению на карте. Кроме того, размер участка, по которому фаг избыточен и гетерозиготен, увеличивается у мутантов, несущих делеций, в связи с особым механизмом упаковки, который мы вкратце рассмотрим ниже. (В отличие от фага А. у фагов Т2 и Т4 делении не уменьшают количество ДНК в головке фага.) Из этих наблюдений можно сделать лишь один логический вывод: не существует единственного уникального порядка генов вдоль всей молекулы ДНК, другими словами, у конкретных фагов в по

страница 35
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Скачать книгу "Современная генетика. Том 1" (4.74Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)