t", Thi- и Pur~ обозначают, соответственно, мутантные штаммы, нуждающиеся в метионине, тиамине и пурине; соответствующие прототрофные фенотипы (дикий тип) обозначаются символами Met + , Thi+ и Pur + .

Мутации в самых различных генах могут давать одинаковые ауксотрофные фенотипы, и соответствующие генотипы обозначают теми же буквосочетаниями, что и фенотипы, но курсивом. Например, мутации met А и metB- это мутантные аллели генов дикого типа met А + и metB +, причем каждый мутант характеризуется фенотипом Met ~. Как мы увидим далее, каждый из этих генов дикого типа необходим для биосинтеза метионина.

Е. coli может использовать в качестве источника углерода многие органические соединения, более сложные чем глюкоза, поскольку обладает способностью превращать молекулы сложных Сахаров в молекулы

глюкозы или других простых Сахаров, а также способностью расщеплять другие типы сложных молекул, например, аминокислот или жирных кислот. Такое расщепление сложных молекул называется катаболизмом. Мутации, затрагивающие катаболические функции, ограничивают типы молекул, которые могут служить источниками углерода для соответствующего мутанта. Например, мутант с фенотипом Lac ~ -не способен к росту в условиях, когда единственным источником углерода служит лактоза (молочный сахар), тогда как дикий тип Lac + способен утилизировать лактозу. Фенотип Lac ~ может возникать в результате мутаций в генах lacZ+ и lacY + , обусловливающих появление му-тантных генотипов lacZ и lacY, соответственно. Заметим, что для того, чтобы определить, способен ли данный штамм к росту на определенной среде, надо знать, затрагивает ли соответствующая мутация анаболическую или катаболическую функцию. Например, мутант Met ~ нуждается для нормального роста в среде, обогащенной метионином, тогда как мутант Lac ~ не может расти на среде, содержащей в качестве источника углерода только лактозу и нуждается в другом источнике углерода. Оба типа мутаций служат удобными условно летальными генетическими маркерами.

Температурочувствительные мутации широко используются и в генетике бактерий. Необходимые для нормального существования (существенные) гены, которые невозможно выявить посредством ауксо-трофных мутаций, обычно могут быть идентифицированы с помощью температурочувствительных мутаций. Примерами жизненноважных функций могут служить функции, связанные с синтезом белков или нуклеиновых кислот из молекул-предшественников-аминокислот или нуклеотидов (подробное обсуждение мутаций, затрагивающих синтез ДНК, содержится в главе 13).

Существуют также мутации бактерий, вызывающие устойчивость к определенным бактериофагам или антибиотикам. Первые из них обычно влияют на способность фага прикрепляться к бактерии-мутанту, поскольку у мутанта несколько изменены белки мембраны. Устойчивые (резистентные) мутанты легко отбираются при посеве клеток, подвергнутых действию какого-либо мутагена, непосредственно на среду, содержащую данный фаг или антибиотик: выросшая бактериальная колония и есть мутант. Мутации, вызывающие устойчивость к определенным антибиотикам, хорошо известны, поскольку они создают серьезную проблему для медицины и здравоохранения. Фенотип устойчивости к фагу Т1, обозначается символом T1R (фенотип чувствительности к фагу-Т1Б). Соответственно, устойчивость и чувствительность к антибиотику стрептомицину обозначают как StrR и Str5. Ген чувствительности к фагу Т1 обозначается как ton, (ton+ -синоним Tls; ген чувствительности к стрептомицину-str (str+ - синоним str^),

Мутантные штаммы легко получить при действии на бактерии дикого типа мутагенных факторов, например, рентгеновских или ультрафиолетовых лучей, или химических мутагенов. Обработанную культуру высевают на пермиссивную среду. Например, если нужно получить ауксотроф по определенной аминокислоте, то сперва подвергнутые действию мутагена бактерии высевают на среду, содержащую все 20 аминокислот. После появления колоний, их перепечатывают на чашку с минимальной средой, для того чтобы определить, какие из этих колоний ауксотрофные (рис. 8.1). Затем каждая из ауксотрофных колоний с перРис. 8.1. Метод перепечатывания колоний, при котором бактерии быстро переносят > с одной питательной среды на другую. На рисунке схематически изображена последовательность операций, позволяющая идентифицировать ауксо-трофные мутанты, способные к росту на исходной обогащенной среде, но не образующие колоний на новой (минимальной) среде. [Stent G. S., Calendar R., (1978) Mol. Genetics, 2nd ed., W. H. Freeman, San Francisco.]

миссивной среды «перепечатывается» на 20 чашек Петри с минимальным агаром, к которому добавлено по одной аминокислоте. При этом выясняется, присутствие какой именно аминокислоты необходимо для роста мутанта. Для отбора температурочувствительных мутантов обработанные мутагеном клетки высевают на чашку и инкубируют при 30°С. Выросшие колонии перепечатывают и чашку-реплику инкубируют при 42°С. Колонии, растущие при пермиссивной температуре 30°С, но не способные к росту при 42°С, образованы fs-мутантами. Подвергая полученные мутанты повторному (и последующему) воздействию мутагена и производя соответствующий отбор, можно получать штаммы, содержащие по нескольку мутаций.

Генетические элементы Е coli

Клетки Е. coli могут содержать по нескольку различных генетических элементов, каждый из которых способен к саморепликации. Хромосома бактерии-это длинная кольцевая молекула ДНК с мол. массой примерно в 2,5-109 дальтон, что соответствует 3,2 х 106 н.п. Как уже обсуждалось а, гл. 4, на бактериальной хромосоме имеется точка (сайт), с которой начинается репликация ДНК, и от которой она распространяется в обе стороны при репликации тета-типа. Генетические факторы, управляющие репликацией бактериальной хромосомы, локализованы в самой хромосоме. Хромосома вместе с сайтом инициации представляют собой самореплицирующуюся генетическую молекулу - репликон по терминологии, которую предложили Франсуа Жакоб, Сидни Бреннер и Франсуа Кузин.

В клетках Е. coli могут содержаться и другие репликоны, способные существовать отдельно от бактериальной хромосомы. Они называются эписомами, и плазмидами, и представляют собой кольцевые молекулы ДНК различных размеров от 103 н. п. до почти трети величины самой бактериальной хромосомы. Одна из наиболее интересных и тщательно изученных эписом получила наименование F-фактора (фактора фертиль-ности). F-фактор определяет половой процесс у Е. coli. Эписома-это генетический элемент, который может существовать либо в форме репли-кона отдельно от бактериальной хромосомы, либо встраиваться в бактериальную хромосому и составлять при этом часть репликона бактерии. Эписомой является и бактериофаг X, способный существовать как вне клетки в форме фага, так и внутри бактериальных клеток, либо в качестве отдельного репликона (при литической инфекции), либо в форме профага, составляя часть бактериального репликона. В противоположность эписомам, плазмиды не встраиваются в другие репликоны, а всегда существуют в форме свободных (автономных) реплико-нов. Умеренный фаг Р1, находясь в состоянии профага, представляет собой плазмиду, существующую отдельно от бактериального репликона. Однако, большинство плазмид не покидают пределов клетки и не образуют внеклеточных форм.

Некоторые эписомы инфекционны, поскольку их копии могут переходить из одной бактериальной клетки в другую, в которой исходно эписом данного типа не было. Генетические функции, необходимые для репликации, инфекционности и способности вытеснять другие эписомы, кодируются эписомальной ДНК. Во многих эписомах содержатся также гены, не необходимые для их существования. Например, некоторые инфекционные эписомы содержат гены устойчивости к определенным антибиотикам. Бактерии, в которые попадает такой фактор устойчивости, становятся устойчивыми к данному антибиотику. Имея высокую селективную ценность в современных условиях насыщения антибиотиками, факторы устойчивости быстро распространяются среди различных штаммов и видов бактерий, в том числе патогенных. Это создает серьезные проблемы для медицины. Особенно опасна способность факторов устойчивости накапливать гены, обусловливающие устойчивость к разным антибиотикам, и передавать ранее чувствительным бактериям множественную устойчивость.

F-фактор: генетический элемент, определяющий пол бактерий

F-фактор обладает поразительной способностью определять пол, казалось бы, бесполых бактерий. Его существование было обнаружено генетиками, когда они пытались определить, происходят ли скрещивания

Рис. 8.2. Использование множественно аук-сотрофных штаммов для демонстрации скрещивания у Е. coli. В этом скрещивании met+, Ыо +, thr + и leu + -селективные маркеры, a ton и lac-неселективные маркеры. [Watson J.D. (1976). Molecular Biology of the Gene, 3rd ed, W. A. Benjamin, Menlo Park, Calif.] [Имеется перевод: Уотсон Дж. 1978. Молекулярная биология гена. М, Мир.]

Очень небольшое число клеток Met* Bio+ Thr+ Leu*. Они возникают в результате генетической рекомбинации, на что указывает поведение маркеров lac и мя(ген, ответственный за чувствительность к фагу Т1). Кроме родительских генотипов lac" ton$ и lac* ton^ в культуре обнаруживаются колонии с генотипами lac" fwjR и lac* ton^

между различными линиями Е. coli. Для этого исследовали возможность генетической рекомбинации между различными мутантными штаммами. Множественные ауксотрофы бактерий, полученные посредством нескольких последовательных этапов мутагенеза и селекции, смешивали и смесь высевали на минимальную среду. Появление колоний должно было свидетельствовать о возникновении рекомбинантов дикого типа, как это изображено на рис. 8.2.

Использование множественных ауксотрофов гарантирует, что колонии дикого типа, способные к росту на минимальной среде, возникают именно в результате рекомбинации, а не вследствие обратных мутаций. Если штамм, ауксотрофный по одной аминокислоте, ревертирует к дикому типу с частотой 1 • 106, то появление колоний дикого типа на минимальной среде можно расценить и как результат реверсии, и как результат рекомб