Биологический каталог




Современная генетика. Том 1

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

r ~ leu ~ azis, то лишь 3% от рекомбинантов типа Thr+ обладают также фенотипом Leu+, и ни один из них - фенотипом AzR. Однако, если отбирать рекомбинанты типа Leu +, то 50% из них составляют AzR. Следовательно, leu + более тесно сцеплен с aziR, чем с thr +, и гены, по-видимому, расположены в последовательности thr + leu + aziR. Частоты совместной транс-дукции (котрансдукции) соответствующих маркеров можно использовать для определения степени их сцепления. Тот факт, что лишь 3% трансдуцирующих фагов thr+ содержат также ген leu +, указывает на то, что эти гены столь удалены друг от друга, что редко оказываются вместе во фрагменте ДНК, попадающем в головку фага Р1. На физической карте, полученной методом прерванной конъюгации, эти маркеры расположены на расстоянии около 1/50 от общей длины хромосомы бактерии, что составляет 6,4 • 104 н. п. Это находится в хорошем соответствии с данными, согласно которым молекула ДНК фага Р1 содержит чуть меньше 105н. п.

Выращивая фаг Р1 на различных штаммах бактерий, а затем используя потомство фагов для трансдукции соответствующих маркеров в другие штаммы, легко производить трехфакторные реципрокные скрещивания. В таких экспериментах используется мутант фага PI, clear, не способный к лизогенизации бактерий. Подобные опыты по трансдукции с использованием реципрокных трехфакторных скрещиваний позволяют определить последовательность мутантных генов в хромосоме в тех случаях, когда, как в приводимом ниже примере, эксперименты по котрансдукции не позволяют этого сделать. Все маркеры trp трансдуци-руются вместе более чем в 80% всех случаев. Представленные в табл. 8.4 данные содержат частоты совместной трансдукции cys + и четырех тесно сцепленных ауксотрофов Trp ~. Частота совместной трансдукции (котрансдукции)-это частота, с которой клетки реципиента, приобретшие прототрофность по цистеину (cys+), приобретают

Рис. 8.17. Перенос ДНК из донорной бактериальной клетки в реципиентную в результате трансдукции фагом Р1. В популяции трансдуцирутощих фагов Р1 можно обнаружить фаговые частицы, несущие любые участки бактериальной ДНК донорного

штамма. После инфицирования фагом реци-пиентной клетки среди рекомбинантов посредством специальной селекции можно выделить носителей желаемого участка ДНК донорной бактерии.

Таблица 8.4. Котрансдукция мутаций ауксотрофности по триптофану с маркером cys +

Генотип донора Генотип реци- Селективный

пиента маркер

Неселективный маркер

Котрансдукция неселективного маркера с

cys + , (%)

cys + trpE cas+trpC су's4trpA су s+trp В cys~trpE+ cys~trpC + cys~trpA + cys~trpB+

cys cysH cysA cysA

trpE trpC trpA trpB

63 53 46 47

По Yanofsky C, Lennox E.S. 1959. Virology, 8, 425

одновременно ауксотрофность по триптофану (Trp "). Мерозиготы при этом сперва высевают на минимальную среду, содержащую триптофан. Образовавшиеся колонии перепечатывают на минимальную среду с тем, чтобы выявить не прототрофные, т.е. обладающие фенотипом Trp ~. Частота котрансдукции позволяет установить порядок генов в хромосоме cys-trpE-trpC-(trpA, trpB), но не позволяет уверенно определить взаимное расположение trpA и trpB, так как различие между 46 и 47% (см. табл. 8.4) статистически недостоверно.

Трехфакторные скрещивания с участием cys, trpE, trpB, схематически изображенные на рис. 8.18, подтверждают, что гены расположены в поДвойные кроссянговеры

Сайт селекти - Возможные сайты неселектируемых

кроссинговеровЛ

Четырехкратный кроссинговер

Сайт селекти -руемого кроссинговера

Донор Реципиент

V cys*

cys'

IT

trpE

i i

trp В

trpE* trpB*

\у cys*

cys~

trp В

trpE

А

Ж.

trpE+ trpB*

л

Рекомбинантные генотипы

cys* trpE trpB cys* trpE trpB* cys* trpE* trpB*

Число

139 18 141

Редкие рекомбинантные генотипы

cys* trpE* trpB

Число

Рис. 8.18. Генетическое картирование посредством рекомбинационного анализа мерозигот, возникших в результате трансдукции. Отбор маркера cys+, относительно которого известно, что он тесно сцеплен с trp, позволяет выделить класс мерозигот, в которые из донорной клетки попадает участок ДНК, содержащий также и rrp-маркеры. Кроссинговер, в результате которого это могло произойти, обозначен цветной стрелкой. Взаимное расположение неселективных маркеров trp устанавливают затем по частотам более редких рекомбинантных классов, возникающих в результате четырехкратных обменов.

Рис. 8.19. Пример использования реци-прокных скрещиваний для установления и подтверждения взаимного расположения маркеров в трех-факторном скрещивании при трансдукции. Для определения последовательности генов выявляют относительные частоты двух указанных рекомбинантных генотипов. Участок, на котором произошел кроссинговер, обозначен цветной стрелкой, а наиболее вероятное расположение второго кроссинговера -черной стрелкой. Менее вероятные локализации кроссинговера указаны пунктирными стрелками.

Последовательность маркеров I

Последовательность маркеров II

Последова-тельность маркеров I

Эксперимент 1 Е С+ А

""ЯГ

Ж.

Ж~

Сайт селектируемого кроссинговера

~ж яг

I I

I I

А+ Е+

Ж ЖА

ж

Эксперимент 1

Е+ С А +

"Ж Ж"

I I

С+ А

Частоты генотипов

Е + С + А+ >ЕС+А +

ЕС+А+ >?+С + Л+

Сайт селектируемого кроссинговера

Поспелова -тельность маркеров II

А+ Б'

"Ж Ж

Ж ж.

Е+С+А + >ЕС+А

С+ А Е

следовательности cys-trpE-trpB. Порядок генов можно установить, зная, что рекомбинантный генотип, появляющийся наиболее редко, возникает в результате четырехкратного кроссинговера. (Сравните частоты генотипов cys+ trpEtrpB и cys + trpE + trpB.) Разделить рекомбинантные классы trpEtrpB + ,trpE+ trpB и trpEtrpB, каждый из которых обладает фенотипом Trp ~, можно, используя селективные среды, в которых отсутствует то или иное промежуточное соединение на метаболическом пути биосинтеза триптофана. Пути биосинтеза и прерывающие их аук-сотрофные мутации подробно обсуждаются в главе 10, сейчас мы рассматриваем эти мутации просто как генетические маркеры, позволяющие различать некоторые генотипы.

Трехфакторные скрещивания в результате трансдукции фагом Р1 позволяют установить на генетической карте взаимное расположение всех генов ауксотрофности по триптофану: ?, С, В и А. Результаты реци-прокных трехфакторных скрещиваний представлены в табл. 8.5. В этих скрещиваниях вектор селектируемых маркеров задает участок, в котором произошел единичный перекрест. Положение участка, в котором произошел второй перекрест, выявляется при исследовании частот комбинаций неселектируемых маркеров. Условием выбора маркеров для проведения трехфакторного скрещивания служат данные о возможности их котрансдукции, полученные в предварительных экспериментах.

Таблица 8.5. Определение взаимного расположения мутаций ауксотрофности по триптофану путем трехфакторных скрещиваний при трансдукции

Опыт

Последовательность, установленная по относительным частотам неселективных маркеров

На рис. 8.19 схематически изображены кроссинговеры, приводящие к возникновению рекомбинантов, полученных в экспериментах 1 и 2 из таблицы 8.5. Выбор одной из двух возможных последовательностей генов основывается на следующих рассуждениях: 1) чем ближе неселективный маркер к селективным, тем меньше частота неселективного кроссинговера между ними; 2) четырехкратный кроссинговер происходит реже, чем двойной. Таким образом, поскольку в первом из изображенных на рис. 8.19 эксперименте генотип ЕС + А+ обнаруживается чаще, чем Е+ С + А +, то гены расположены в последовательности Е-С-А. Правильность такой последовательности подтверждается ре-ципрокным скрещиванием (эксперимент 2), в котором тоже наиболее часто встречается генотип ЕС + А +.

Картированные гены ауксотрофности по триптофану образуют опе-рон (см. гл. 15), в котором последовательность расположения генов соответствует последовательным биохимическим реакциям, приводящим к синтезу триптофана. Мы уже видели, что мутации, влияющие на утилизацию лактозы, расположены в хромосоме очень близко друг от друга (рис. 8.16). Такое «кучное» расположение генов, определяющих родственные генетические функции-это один из наиболее важных фактов, обнаруженных при изучении генетической организации бактерий. Вспомним, что кучное расположение генов, определяющих родственные функции, наблюдалось у бактериофагов X. .и Т4 (гл. 7). Такая генетическая организация не случайна: она, по-видимому, отражает фундаментальные основы регуляции генетических функций у прокариотических организмов.

Обзор результатов генетического анализа

В главах 5-8 мы видели, как генетический анализ позволяет определить общую организацию генетического материала у эукариотических и про-кариотических организмов, и их вирусов. Комплементационный тест позволяет относить мутации к различным функциональным единицам. С помощью рекомбинационного анализа удается устанавливать взаимное расположение этих единиц и строить генетическую карту, представляющую собой модель хромосомной организации функциональных генетических единиц. Мы увидели, что генетические модели организации наследственного материала очень хорошо соответствуют реальной физической структуре ДНК. Кроме того, мы убедились в том, что генетический анализ может использоваться для изучения изменений тонкой структуры генов - изменений, затрагивающих отдельные пары нуклеотидов.

В последней главе первой части мы рассмотрим, как генетики используют генетические элементы прокариот для исследования тонкой структуры генетической организации прокариот и эукариот. Эти новые методы заложили основы «рекомбинантной революции в исследовании ДНК» и привели к появлению генетической инженерии. Изучив физическую и генетическую организацию генома, во второй части нашей книги мы вернемся к рассмотрению механизмов функционирования генов и к изучению того, каким образом гены определяют фенотип организма.

Литература

Bukhari АЛ., Shapiro J. A., Adhya S.L., eds., 1977.

DNA Insertion Elements, Plasmids, and

Episomes, Cold Spring Harbor Laboratory,<

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Скачать книгу "Современная генетика. Том 1" (4.74Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)