p>Cold Spring Harbor, N. Y. Jacob F., Wollman E., 1961. Sexuality and the

Genetics of Bacteria, Academic Press, New

York.

Miller J. H., ed., 1972. Experiments in Molecular

Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. Yanofsky C, Lennox E. (1959). Transduction and recombination study of linkage relationships among the genes controlling tryptophan synthesis in Escherichia coli, Virology, 8, 425-447.

Ключевые слова и понятия

Анаболизм Ауксотроф Катаболизм Инсерция (IS) Конъюгация

Конъюгационная трубка Конъюгационное картирование Котрансдукция

Мерозигота Неселективный маркер Общая трансдукция Перепечатывание колоний Плазмида

Прерванная конъюгация Репликон

Селективный маркер

Специфическая трансдукция Эписома —у

Трансдукция Hfr-штамм

Трансдукционное картирование F-фактор

Транспозон F'-штамм

Трансформация F + -штамм

Фактор устойчивости к антибиотикам F ~ -штамм

Задачи

^ 8. ^Последовательность передачи генов ^Ч^зличных Hfr-штаммов Е. coli различна; для нескольких штаммов она представлена ниже. Постройте на основе этих данных физическую карту бактериального генома.

Hfr-штамм Последовательность передачи

генов

I АСЕ

II D В Е

III Е В D

IV С A D

( 8.2. Для определения взаимного расположения генов А, В, С и D на генетической карте использовали метод прерванной конъюгации. Hfr-штамм leu + А + ,В + ,С +, D + Srrs передающий ген leu + в самом начале скрещивания, скрещивали со штаммом F "" leu ~ А ~ ,В ~ ,С ~ ,D ~ Str*. Определите взаимное расположение генов А, В, С и D, используя гены Str11 и leu + в качестве селективных маркеров (рис. 8.20).

I 8.3?Для определения взаимного расположения нескольких ауксотрофных мутаций Е. coli проводили эксперимент по прерываемому скрещиванию между про-тотрофным штаммом HfrStr5 и штаммом F ", А~ ,В~ ,D~ ,S?r*. В качестве селективных маркеров использовали устойчивость к стрептомицину и прототрофность по D. Определите расположение генов А и В относительно D, считая, что D + передается при скрещивании последним.

Генотип колоний D + StrR Д о ля колоний D + StrR(%)

А + В + 22

А~В + 10

А~В~ 68

А + В~ 0

^8.4^Для определения взаимного расположения нескольких ауксотрофных мутаций Е. coli использовали данные по трансдукции фагом Р1. Проанализируйте приведенную таблицу и установите порядок следующих генов: А, В, С, D и F.

a- s а о

_ Котрансдук? ?-? - - D - В Генотип донора Генотип реципиента Селек-тивный маркер ция неселективного маркера дикого типа с селекА тивным мар кером (%)

. - С A+G+ A~G~ A + 80

i i л i '" i i A + D+ A~D~ A + 30

10 30 60 А+Е+ A~E~ A + 0

Продолжительность конъюгации (мин) D+E+ D~E~ D + 30

D+F + D~F~ D + 5

Графическое представление резуль- E+F + E~F~ E+ 75

татов скрещивания.

У - Л

Hfr-штамм

8.5. /При скрещивании F~-штамма с различными Hfr-штаммами последовательность переноса генов различна. В таблице приводится порядок переноса различными Hfr-штаммами нескольких генов, расположенных неподалеку от точки начала (0). На основании этих данных постройте физическую карту бактериальной хромосомы.

Порядок переноса генов

н 0~~thr- -leu— -ari— ton- -pro- -lac—

—ade

4 O—thi- -met- -ile- -mtl- -xyl- -mal—

—str

6 O—ile- -met— -thi— -thr— -leu~ -azi—ton

АВ311 O—his- -trp— -gal— -ade- —lac- —pro—

—ton

АВ313 0~mtl- -xyl- -mal- —str- —his

\ 8.7. Студент-генетик получил задание определить положение на карте ауксо-трофной мутации, которую он на основаf 8.6ЛДЛЯ того, чтобы определить поло-жёнле/ена arg7 + на карте хромосомы Е. coli, прототрофный штамм StrsHfr4 (см. условие предыдущей задачи) скрещивали со штаммом F~,Met~ Mtl" St^argl'. После того как скрещивание прерывалось, образцы культуры высевали на чашки, содержавшие глюкозу в качестве источника углерода, стрептомицин и аргинин (или метионин). По приведенным в таблице данным определите расположение гена агд7 +.

Время до прерывания скрещивания (мин) Число рекомбинантов

Arg+StrR Met+StrR

0 0 0

6 0 0

8 3 0

10 19 4

11,5 56 28

13 126 62

14,5 217 183

нии данных по трансдукции считает тесно сцепленной с геном his. Он ставит конъю-гационное скрещивание штамма Hfr АВ313 Str5, Ade ~ Tls (см. условие задачи 8.5) с ауксотрофным штаммом F ~ StrU,Ade + TlR. После прерывания конъюгации образцы суспензии он высевает на среду, содержащую глюкозу и стрептомицин. Рекомбинантов обнаруживается очень мало, и их недостаточно для того, чтобы установить тесное сцепление. Со своими трудностями он обращается к преподавателю. Тот советует ему исключить из среды стрептомицин и повторить эксперимент. Студент пользуется советом и получает надежные данные, показывающие, что ген, положение которого он должен определить, попадает в F ~ -клетки за две минуты до гена his. Объясните, что было неправильно в первом эксперименте, и почему во втором случае эксперимент удался. Предложите другую схему эксперимента.

8.8. Изобразите схематически рекомбинанты, которые могут быть выделены из нового F'-штамма, в котором F'-эле-мент содержит гены thr + leu ~, а бактериальная хромосома-гены thr ~ leu + . Обозначьте положение полового фактора в каждом рекомбинанте.

8.9. Предложите два способа определения того, принадлежит ли отобранная после скрещивания Hfr и F"-штаммов ре-комбинантная колония типу F' или F ".

8.10. Установлено, что определенный

штамм Е. coli, требующий для роста метионин, содержит в гене met элемент IS1,

инактивирующий этот ген и вызывающий

потребность в метионине. Из этого штамма выделено множество спонтанных мутантов с делениями, затрагивающими

смежный по отношению к гену met оперон

ilv. Носители этих делеций, кроме метионина, нуждаются также в изолейцине и валине. Каждый из штаммов с одной из делеций используется в качестве донорного

для трансдукции фагом Р1 маркеров ilv +

в реципиентные штаммы ilv ~. Используются реципиентные штаммы ilv А ~,

ilv В ~, ilvC ~ и ilvD ~ . В приводимой таблице указано присутствие ( + ) или отсутствие ( — ) рекомбинантов ilv + в каждом

опыте. Определите расположение мутаций ilv ~ друг относительно друга и относительно гена met.

Доля колоний, содер-Реципиент Донор жащих неселективный маркер (%)

Доноры

2 3 4 5 6

Реципиенты

ilv A ilv В Не С

_ + + + +

+ +

ilv D

leu leu leu leu leu leu

ara 2

ara 1

ara 3

ara 1

ara 3

ara 2

thr ara 1

thr ara 2

thr ara 1

thr ara

thr ara

thr ara

По Gross Y, Englesberg (1959) Virology 9, 314

Генотип реципиента

Селективный маркер

thr+

ara 3 leu thr leu+

thr+leu+

ara

ara 6,7 55,4 80,0

Доля колоний, содержащих неселективный маркер {%)

leu+ thr+

4,1 - 1,9

72,6 4,3

8.13, Когда в качестве реципиентных

используются клетки агаЗ, а донорными

клетками для фага Р1 служат aral, ara 2

или клетки дикого типа, и отбираются

трансдуктанты Ara+, то на селективной

среде наряду с крупными колониями появляются крошечные колонии, неразличимые невооруженным глазом. Сформулируйте гипотезу об их происхождении.

8.14. Клетки некоторых штаммов

Salmonella paratyphi подвижны, поскольку

обладают жгутиками; клетки других

штаммов лишены жгутиков и неспособны

к самостоятельному движению. Фаг, осуществляющий общую трансдукцию

у Salmonella (Р22), выращивают на подвижных клетках и инфицируют им неподвижные клетки. Когда инфицированные

клетки неподвижного штамма высевают

на поверхность столбика из мягкого агара, то после инкубации можно увидеть тянущиеся вглубь агара от поверхности цепочки мелких колоний (рис. 8.21).

\ 8.12. Мутации aral и ara2 очень тесно сцеплецы с агаЗ. Все они делают клетки Е. coli неспособными к использованию ара-бинозы в качестве единственного источника углерода. Для того, чтобы установить взаимное расположение этих мутаций, проводили реципрокные трансдук-ционные скрещивания, результаты которых представлены в таблице. Во всех случаях отбирали рекомбинанты Ara+ и среди них определяли долю носителей неселективных маркеров leu + и thr + . Каково взаимное расположение этих маркеров?

В культурах, выделенных из этих колоний, все клетки оказываются неподвижными. Объясните.

8.15. При некоторых скрещиваниях с участием лизогенных штаммов профаги типа X могут использоваться в качестве бактериального генетического маркера. В таблице представлены результаты скрещивания между нелизогенным [ (1у) ~ ]

Профаг Доля нелизогенных рекомбинантов

Thr + Leu+StrR Gal + StrR

X 0,16 0,82

21 0,01 0,10

82 0,21 0,89

434 0,11 0,68

424 < 0,01 0,03

381 0,025 0,15

о

штаммом HfrН, Str и штаммами F Thr ~ Leu ~ Gal ~ StrR, лизогенными по одному из нескольких различных профа-гов, например, F " ,Thr " Leu " Gal" StrR (X). Отбираются рекомбинанты Thr +

Leu + StrR или Gal+ StrR и среди них определяют долю (ly ~ )Hfr. О наличии маркера 1у ~ судят по чувствительности к соответствующему фагу, другими словами, утрата профага рекомбинантом интерпретируется как наличие неселективного маркера. На основании этих данных определите взаимное расположение профагов на физической карте Е. coli и их положение относительно Thr + Leu + и Gal+.

8.16. При скрещивании штамма Hfr, лизогенного по фагу X, с нелизогенным F"-штаммом может иметь место феномен, называемый зиготической индукцией. Что это такое можно понять, сравнивая рекомбинанты, получаемые в реципрок-ных скрещиваниях между содержащими профаги штаммами HfrHStrS и F-,Thr-Leu~ArBTlRLac~gal"StrB, результаты которых приведены в таблице. Основываясь на представленных в таблице данных о частоте возникновения рекомбинантов при зиготической индукции, постройте гипотезу, объясняющую этот феномен, и предложите постановку эксперимента для проверки вашей гипотезы.

Скрещивание Отношение Thr+Leu + StrR Селективные и неселективные маркеры в тэекомбинантах: thr+leu+strR (селективные) gal+str (селективные)

Gal+StrH Частота неселективных маркеров Частота неселективных маркеров

ШтН(ХГ х F~(X}+ HfrH