Биологический каталог




Современная генетика. Том 1

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

(Х)+ xF~(Xy 3,7 54 •S S

azi ton tac+ gal+ X 0,92 0,73 0,49 0,31 0,15 0,86 0,60 0,21 0,025 0,001 thr+leu+ azf tonS lac + 0,75 0,75 0,74 0,74 0,82 0,79 0,78 0,74 (X) 0,84 0,01

Методы работы с ДНК

Наследственная информация кодируется последовательностью нуклеотидов в молекуле ДНК. Любая экспериментальная методика, предназначенная для определения последовательности нуклеотидов, требует химически чистых препаратов ДНК. Слово «чистый» в данном случае означает не только отсутствие примесей других типов молекул, например РНК и белков, но и гомогенность нуклеотидных последовательностей. Все молекулы ДНК в таком образце должны быть одинаковы как по размерам, так и в отношении последовательности нуклеотидов. По этой причине первыми для изучения генетической организации на уровне нуклеотидов были выбраны вирусы прокариотических и эукариотических организмов. Геномы вирусов относительно малы, и вирусные частицы можно довольно легко отделить от клеточного материала еще до химического выделения интактных молекул ДНК из вирусных частиц. Описанное в гл. 7 гетеродуплексное картирование фага X основано на умении генетиков выделять интактные молекулы ДНК из различных линий фага X, геномы которых с генетической точки зрения уже изучены. То же самое относится и к исследованиям, показавшим концевую избыточность нуклеотидных последовательностей фагов Т2 и Т4 и циклические перестановки в их геномах.

Напротив, огромная длина молекул ДНК бактериальных хромосом и хромосом эукариот делает эти молекулы очень уязвимыми в отношении разрывов при их выделении из клеток. Разрывы происходят случайно вдоль двойной спирали, и в результате возникает сложная смесь более мелких молекул ДНК, отличающихся друг от друга длиной и последовательностью нуклеотидов. Извлечь из такой смеси химическими методами информацию об исходной конкретной последовательности нуклеотидов в интактной хромосоме невозможно.

В 1970 году Смит и Вилкокс получили чистый препарат нового типа нуклеазы из бактерии Haemophilus unfluenzae. Это событие оказалось решающим для дальнейших исследований. Выделенная ими нуклеаза расщепляла молекулы ДНК, разрывая фосфатные связи не в произвольных местах, а в определенных последовательностях нуклеотидов. Это открытие, а также создание методов клонирования относительно небольших фрагментов двухцепочечной ДНК привело к «рекомбинантной революции» в исследованиях ДНК и послужило основой современных генетических и биохимических исследований. Метод рекомбинантных ДНК решил проблему получения препаратов ДНК, содержащих молекулы одинакового размера и с одинаковой последовательностью нуклеотидов.

Прежде чем перейти к подробному рассмотрению этого метода, мы сначала познакомимся с информацией, которую можно получить при случайном расщеплении ДНК и, соответственно, при исследовании неоднородной смеси нуклеотидных последовательностей. Хотя информация, полученная такими методами, носит статистический характер, тем не менее до 1970 г. она играла важную роль в описании общих закономерностей организации последовательностей ДНК многих организмов. Эта информация была получена из теоретических и экспериментальных исследований реассоциации одноцепочечных фрагментов ДНК.

Кинетика ренатурации ДНК

Если комплементарные цепи нативной двухцепочечной ДНК разделить посредством нагревания или в щелочной среде, то при правильно выбранной температуре и концентрациях солей в растворе, они довольно легко снова образуют двойную спираль. Мы уже встречались с несколькими примерами такой реассоциации при обсуждении образования гетероду-плекса ДНК в главах 7 и 8.

В реакции ренатурации, как показано на рис. 9.1, можно выделить две отдельные стадии. Первая стадия-нуклеация-заключается в образовании ВОДОРОДНЫХ СВЯЗеЙ Между неСКОЛЬКИМИ, Принадлежащими Двум разНативная ДНК

Ренатурированная ДНК

Рис. 9.1. Последовательные этапы денатурации и ренатурации фрагментов ДНК. Ренатурация требует осуществления двух отдельных реакций: (1) нуклеации - образования водородных связей между двумя одноцепочечны-ми фрагментами; это бимолекулярная реакция, т.е. реакция второго порядка; (2) застегивания, при которой водородные связи образуются между всеми основаниями комплементарных нитей; это мономолекулярная реакция, т.е. реакция первого порядка.

1,0

о

* 0,5

в1 о В

=f

о

ч Начальное состояние Ч

,.,Л

Реакция прошла половину^ -\

\\

Конец реакции

о

1=1

J I LLLLLLL I .I-1 I 1,1111 IU J, МИН!.. I I I I I I I>J I V М NU.

0,01 0,1 I 10

Начальная концентрация • время, c0t (логарифмическая шкала)

100

Рис. 9.2. Кинетика идеальной реакции второго порядка при кг = \. По ординате отложена доля одноцепо-чечных фрагментов в реакционной смеси по прошествии t секунд от начала реакции. По абсциссе отложена

где с0-начальная концентрация одноцепочечной ДНК в молях нуклеотидов на литр.

ным цепям комплементарными основаниями; остальные взаимно комплементарные основания выстраиваются друг против друга. На данной стадии происходит образование связи между двумя разными одноцепо-чечными молекулами. Это реакция второго порядка, ее скорость пропорциональна квадрату концентрации ДНК. Вторая стадия - реакция «застегивания молнии», при которой устанавливаются водородные связи между выстроенными друг против друга комплементарными нуклеотидами. Эта стадия представляет собой мономолекулярную реакцию; скорость образования водородных связей пропорциональна концентрации ДНК, т. е. кинетически является реакцией первого порядка. Какая из этих двух стадий идет медленнее и, следовательно, определяет общую скорость ренатура-ции ДНК, должен решать эксперимент. Показано, что лимитирующей является стадия образования первых связей между цепями.

Зависимость концентрации одноцепочечной ДНК от времени в процессе реакции ренатурации описывается гиперболической функцией (вывод формулы приводится в дополнении 9.1). График зависимости концентрации от времени при k2 — 1 изображен на рис. 9.2. С помощью этого уравнения по времени (tlj2), необходимому для ренатурации половины исходного количества ДНК (с/с0 = 0,5), можно определять показатель реакции ренатурации (с0г1/2). Эта величина прямо пропорциональна числу нуклеотидов в неповторяющейся последовательности ДНК. Эта закономерность иллюстрируется на рис. 9.3 для нуклеиновых кислот, полученных из различных объектов. Другими словами, мы можем определить общий объем уникальной генетической информации, кодируемой ДНК, измеряя значение c0t 1/2 ! Более того, экспериментально определяя кривые ренатурации ДНК, мы можем установить присутствие в геноме повторяющейся генетической информации.

На рис. 9.4 сравниваются кинетика ренатурации ДНК прокариот и эукариот. Обратите внимание на то, что кривая ренатурациии ДНК Е. coli

10 ю2

~\ rЧисло нуклеотидных пар (сложность ДНК)

I 103 i 10" 10s^ 106 ^ 107

_l 1

10*

10Д

10'°

Н

о

1,0

Poly U + Poly А

• **^-Е- C0li

• *

* •

ДНК теленка ^/(фракция \

уникальных фПоследова-• тельностей % без повторов)

1,0

0,5

0,5

о

о

Сателлитная ^ фракция ДНК мыши

О

10"

10"

10"

10"

10*

10"

10

I I 11 mil I I и mil il i i i и ml i hi hill i i 11 mil i i i I i i 1 in il i i 11 mil I

10г

i 'I U_L

104

c01 (моль • сек/л)

Рис. 9.3. Взаимозависимость между экспери- ном значении с0 время, необходимое для рементально определенными значениями c0tl/2 натурации половины молекул, пропорциои сложностью (N) использованных в экспе- нально N. [Britten R.J., Kohne D.E. (1968).

тики ДНК коровы по форме качественно отличается от изображенного на рис. 9.2. ДНК теленка содержит последовательности рена-турирующие как быстрее, так и медленнее последовательностей ДНК Е. coli. [Britten R.J., Kohne D.E. (1968). Science, 161, 529.]

рименте фрагментов ДНК. При фиксирован- Science, 161, 529.]

Рис. 9.4. Сравнение кинетики реассоциации фрагментов ДНК Е. coli и фрагментов ДНК теленка. Форма графика для ДНК Е. coli очень близка к теоретической кривой, представленной на рис. 9.2, что указывает на то, что ренатурация ДНК происходит при единственном неизменном значении константы скорости реакции к2. Напротив, график кинеРис. 9.5. На рисунке в виде спектра изображена частота последовательностей ДНК мыши с различной по-вторностью. Число копий каждого типа последовательности оценивали по кинетике ренатурации ДНК мыши.

р. к

П

* 10% (1 000000 копий)

20% (1000 - 100000 копий)

_L

J.

5 4 3 2 1 logl0 числа повторов

почти тождественна теоретической кривой, представленной на рис. 9.2. Так как теоретическая кривая получена на основе предположения о том, что скорость реакции второго порядка к2 неизменна, это означает, что ре-натурация фрагментированной ДНК Е. coli характеризуется определенным значением к2. Что касается ДНК теленка, то, напротив, некоторые фрагменты ренатурируют со скоростью, много большей скорости ренатурации фрагментированной ДНК Е. coli, тогда как остальная ДНК (около 60%) ренатурирует много медленнее. На основе этих наблюдений можно заключить, что геном эукариот (в данном случае геном теленка) содержит как нуклеотидные последовательности, представленные в геноме лишь в единственном экземпляре, так и различные нуклеотидные последовательности, каждая из которых многократно повторена в геноме. Так, например, основываясь на кривой ренатурации, можно показать, что геном мыши содержит сложный набор нуклеотидных последовательностей, частота представленности которых в геноме схематически изображена на рис. 9.5.

Организация и возможные функции многократно повторяющихся нуклеотидных последовательностей в геноме эукариот были в 60-х годах, после их открытия, предметом активного обсуждения. Около 10% генома мыши составляет совокупность тандемно расположенных последовательностей примерно из 10 нуклеотидов, повторенных 106 раз (рис. 9.5). Эти последовательности ДНК локализованы преимущественно в окружающем центромеры гетерох

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Скачать книгу "Современная генетика. Том 1" (4.74Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)