зможным благодаря действующей m vitro системе упаковки, полученной из инфицированных фагом X клеток Е. coli. Эта

система содержит все структурные белки и ферменты, необходимые для того, чтобы инфицирующие частицы фага были носителями векторной ДНК, в том числе ферменты, разрезающие длинные контамерные молекулы ДНК.

ся» из любых молекул ДНК физическими методами; границы фрагментов при этом не зависят от распределения сайтов рестрикции.

Геном бактериофага X был превращен генными инженерами в наиболее удобный вектор для клонирования крупных фрагментов чужеродной ДНК. В геноме фага X есть два участка, не содержащие генов, необходимых для литического развития и производства потомства. Эти участки включают, соответственно, 22 000 нуклеотидных пар в середине карты и 3000 между генами Р и Q (см. рис. 7.7). Таким образом, около

25000 пар нуклеотидов ДНК фага X можно заменить чужеродной ДНК, не затрагивая способности этого фага выступать в роли вектора. Нормальный геном фага X содержит 49000 нуклеотидных пар, однако головка фага может вместить от 38 000 до 53 000 н. п., продолжая при этом функционировать нормально. Можно сконструировать множество различных линий фага X, предназначенных для клонирования разнообразных фрагментов чужеродной ДНК, подчиняющихся лишь сформулированным выше ограничениям. Примерами таких векторов могут служить так называемые харон-фаги X (по имени мифического перевозчика в царство мертвых) и ^gt-фаги (осуществляющие общую трансдук-цию). Они сконструированы таким образом, что гены, ответственные за жизненно важные функции, локализованы на левом и правом концах генома, а середина существенных генов не несет и кроме того ограничена двумя различными сайтами рестрикции. Эта центральная часть генома содержит гены, влияющие на морфологию колоний, так что по их форме можно сразу определить, чужеродная или собственная ДНК включена в головку. Использование харон-фагов X при клонировании фрагментов чужеродной ДНК схематически изображено на рис. 9.14.

Библиотеки геномов

Одна из основных целей клонирования различных фрагментов ДНК прокариотических и эукариотических организмов состоит в расчленении геномов на участки, достаточно малые для того, чтобы было возможно их детальное исследование. Интуитивно представляется очевидным, что, если накопить достаточно большое количество клонируемых фрагментов ДНК, эта коллекция будет включать по меньшей мере по одному экземпляру каждой последовательности генома. Такую коллекцию клонируемых фрагментов называют библиотекой генома или банком генов.

Если клонируют фрагменты генома Drosophila melanogaster средней длины 15-20-103 н. п., то для того, чтобы в коллекции были представлены все участки генома, достаточно около 40000 независимых клонов (общая длина генома составляет около 1,5-108 н. п.). Для полной библиотеки генома человека требуется около 800000 клонов (см. дополнение 9.2). В библиотеке генов содержится вся наследственная информация организма. Однако определение того, какой именно из томов библиотеки (т. е. клонов) содержит необходимую в каждом конкретном случае информацию, представляет очень сложную для генетиков проблему. Если копия соответствующей генетической информации оказывается доступной в форме структуры молекулы РНК или в форме последовательности аминокислот, то это может быть использовано при отыскивании в библиотеке клона, содержащего требуемую информацию.

Такой поиск осуществляют следующим образом. Библиотеку фагов X высевают на большую чашку Петри, так чтобы на чашке было приблизительно 10000 негативных колоний. Например, библиотека генома Drosophila melanogaster умещается всего на четырех таких чашках. Каждая негативная колония содержит химерные инфекционные фаги и большое количество химерных молекул фаговой ДНК, не уместившихся в головки фагов. Эта свободная ДНК дает возможность определить, какие именно из негативных колоний содержат интересующие нас

с пленок смывали остаток не вступившего в гибридизацию зонда, и подвергали радиоавтографии. Черные пятнышки соответствуют негативным колониям, в которые включился радиоактивный зонд. Сравнение пятнышек на двух экземплярах пленки позволяет отличить случайные «позитивы», проявившиеся лишь на одной из двух пленок, от истинных, проявившихся на обеих.

Рис. 9.15. Поиск в библиотеке генома тутового шелкопряда генов оболочки яйца. На рисунках (А) и (Б) представлены две пленки, снятые с одной и той же чашки Петри, содержащей 5000 негативных колоний. Обе пленки выдерживали некоторое время с меченной Р32 кДНК, полученной с помощью обратной транскрипции из мРНК, выделенной из развивающихся ооцитов. Затем

фрагменты ДНК. К поверхности чашки Петри прикладывают специальную пленку, на которой отпечатываются все негативные колонии. Затем пленку снимают и помещают в раствор щелочи, денатурирующий ДНК. Пленку высушивают и выдерживают в вакууме при температуре 80°С, что приводит к установлению ковалентных связей между отпечатанными одноцепочечными молекулами ДНК и пленкой.

На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так называемый зонд, т.е. одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует интересующий нас ген; это может быть также искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, который кодируется разыскиваемым нами геном; наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибриди-зировать с зондом (рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК.

Труднее выделить из библиотеки клоны, соответствующие генам с известным фенотипическим проявлением, но неизвестным непосредственно биохимическим продуктом функционирования. Метод, с помощью которого эту задачу можно решить, был впервые предложен применительно к геному дрозофилы Бендером и Хогнессом и получил название «прогулки по хромосоме». Этот метод требует, чтобы, во-первых, была заранее известна локализация интересующего нас гена на генетической карте политенной хромосомы {см. главу 5, например, рис. 5.19) и, во-вторых, чтобы для какого-нибудь гена той же хромосомы существовал зонд.

Рассмотрим в качестве примера участок Х-хромосомы, изображенный на рис. 5.19, и будем двигаться по хромосоме, как это изображено на рис. 9.16. Наша цель состоит в том, чтобы отыскать в библиотеке клонируемые фрагменты ДНК, отвечающие гену dunce, локализованному в хромомере 3D4. Этот ген необходим для формирования нормальной памяти у мух; при этом он также кодирует фермент сАМР-специфическую фосфодиэстеразу. Прогулка по хромосоме начинается с рекомбинантного клона XcDm 1570, несущего ДНК из хромомера ЗС11-12. Этот химерный фаг извлекается из библиотеки генов дрозофилы посредством гибридизации с информационной РНК, выделенной из слюнных желез личинок. Эта информационная РНК кодирует клейкий белок, обозначаемый символом Sgs-4. Генетическое картирование мутаций, затрагивающих Sgs-4, позволяет локализовать этот ген в полосе 3011-12 политенной хромосомы (рис. 9.16). Клонированная ДНК Sgs-4 гибридизирует с ДНК из полосы ЗС11-12 политенной хромосомы, расположенной непосредственно справа от левого края делеции Df (1 )d-m7 5ei9 можно показать, используя разработанный Эдвином Сау-зерном метод перенесения электрофоретических фрагментов ДНК на специальную пленку, связывающую одноцепочечные молекулы ДНК (блотинг по Саузерну; см. рис. 9.6). Затем на эту пленку наносят радиоактивный зонд, что позволяет определить, какие из фрагментов ДНК в геле комплементарны последовательности нуклеотидов зонда. Этот метод схематически изображен на рис. 9.17.

Используя метод Саузерна при сравнении нормальных мух и мух, в геноме которых имеются делеции, можно локализовать концы этих делеции, если использовать в качестве зонда клонируемую ДНК. О нарушении нормальной нуклеотидной последовательности в делетирован-ной хромосоме свидетельствует изменение распределения сайтов рестрикции по сравнению с ДНК нормальной хромосомы. Например, если конец делеции находится между двумя сайтами рестрикции нормальной ДНК, то расстояние между оставшимся сайтом и следующим (внутри делеции) изменится, поскольку почти наверняка следующий сайт в делеции окажется на другом расстоянии от сохранившегося, чем был первый. На рис. 9.18 показано использование метода Саузерна для определения нового распределения сайтов рестрикции.

На рис. 9.18, А представлены результаты опыта, в котором ДНК мух дикого типа (Oregon-R) и Df(1 )dm75ei9/Df(l)N6*j15 подвергали действию Hin dill, а затем сравнивали методом Саузерна, используя в качестве радиоактивного зонда ДНК дрозофилы из клона XcDm2151. Обратите внимание на то, что распределение сайтов рестрикции в обеих ДНК одинаково, так как ДНК дрозофилы из Xx:Dm2151 комплементарна последовательности и нормальной ДНК, и ДНК из хромосомы с де-лецией Df(l)dm15el9. (Обратите также внимание на то, что, как это видно на рис. 9.16, в хромосоме с делецией Df (1 )N64j15 отсутствует

D/fJjN64)'5

Df(l)dm7

5^4-N

?> * ^ i at-*"

Л 1 Л Л Л л л

1-3 456 1234 5 6 7 89 - 1 2 34 123 • 56 7 8-10-12 12dnc

Л Л Л Л л л л

56 12 4 3 5 6 7 8 12-45-782 3

1.0

15,8+4,0 8,5 1,9 5,1 3,2 4.8 J 4 7,3 50 9,5 1,3 2,2 3,5 5.5 1,7 4.7 Й.9

Xhol h 1 н—I—I—H 1—I HH—I 1 H 1

0?

0,8 +

1.1+

H4,2 2,4 4-5 6,5 +Hf

2.13tf4|5 5,0 8,6 0,6 2,0 8,5 2,1

1,1

12,5 2,03,4 3,0 5,9 1,6 &8

1 I II

9,0

83

Bam HI ? \cDm2151

2