Биологический каталог




Современная генетика. Том 1

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

,9 7,8 33+—I 1 h

3,2

| |hj|>ml570 |

XcDm2001

XcDml568

'-mm

,XdDm2101

^dPm2106 | . XcDm21O0

XdDm2209

XdDih2301

XcDm2301.

XcDmMOS.

XcDm2602

XdDrniSOO

Dfttjid75'19

*—

WON**"*

< »

Рис. 9.16. Карта рестрикции участка Х-хромосомы Drosophila melanogaster, полученная при анализе перекрывающихся фрагментов ДНК клонированных в харон-фагах X. и отобранных методом «прогулки по хромосоме» слева направо, как это описано в тексте. На рисунке представлена карта участка протяженностью около 100 000 н. п. Серыми полосами изображены концевые точки некоторых из хромосомных перестроек; ширина полос соответствует точности, с которой локализованы концевые точки перестроек на рестрик-ционной карте.

Рестрикация и электрофорез в агарозном геле

Окраска геля

>

Фотографирование

Гель помешают на влажную фильтровальную бумагу (между ^ двумя пластиковыми прокладками)

Нейтрализация (промывка геля в 1М трис, рН 5,5, 2MNaCl)

Денатурация фрагментов ДНК {промывка геля в спирте, 0,5 М NaOH;l,5MNaCi)

Буфер поднимается по фильтровальной бумаге, перенося фрагменты ДНК . ДНК химически связывается с нитроцеллюлозой при выдерживании при температуре 80° С в течение двух часов. После этого нитроцеллюлозный фильтр готов к гибридизации с радиоактивным зондом

Рис. 9.17. Метод Саузерна. Молекулы ДНК обрабатывают рестриктазами и образовавшиеся фрагменты подвергают электрофорезу в агарозном геле. Размеры рестрикционных фрагментов определяют по фотографиям геля, окрашенного бромистым этидием. Затем фрагменты денатурируют и переносят на пленку из нитроцеллюлозы с помощью фильтровальной бумаги. Фрагменты ДНК

ковалентно связываются с пленкой, после чего пленку обрабатывают радиоактивным зондом к подвергают радиоавтографии. Сравнение радиоавтографа с фотографией окрашенного после электрофореза геля позволяет определить рестрикты, комплементарные радиоактивному зонду. [Rodriguez R. L., Tait R. С, University of California, Davis.]

участок ДНК вокруг полосы ЗС11-12, так что анализируется лишь ДНК из хромосомы Df(l )dm15e19.) Сравним теперь те же фрагменты, используя в качестве радиоактивного зонда ДНК дрозофилы клона XcDm 1570, который имеет общий участок с ДНК клона XcDm2151 (рис. 9.16). Распределение сайтов рестрикции при этом (рис. 9.18, Б) получается совершенно иным. Фрагменты, образующиеся при рестрикции нормальной ДНК, теперь отсутствуют, и имеется лишь один фрагмент другого размера в ДНК хромосомы Df(1 )dm15eig. Внимательное рассмотрение

Hin dm

Hin dill

Sad

?n ой •3- jj» 2 О

^ ой 2 О vr 1С

kb

kb

kb

8.8

. 2.9 9.0 -5.93.8 -2.8

W 15.0

и.о

2.3

Зонд

2151

1570

1570

Теломера

5' > 3'

Центромера>

AcDm2151

XcDml570

Hin dill

5.2 , 3.0 1.2 2.9 , 3.4 ,1.9, 9.0

6.2 , 3.8 , 2.8

Sac I —\9.6

да

15.0

11.0

, 2.3,

Df(l) dm

75 ?19

Рис. 9.18. Локализация концов хромосомных перестроек на карте сайтов рестрикции ДНК. ДНК мух с генотипом Df(l)dm15el9/Df(\)N64J15 сравнивают с ДНК мух дикого типа линии Oregon-R. Сравнение проводят по методу Саузерна. Фрагменты рестрикции идентифицируют с помощью

гибридизации радиоактивной ДНК харон-фа-гов AeDm2151 и AcDml570. В хромосоме Ј>/(l)N64jls полностью отсутствует ДНК из участка, содержащего ген Sgs-4 и, следовательно, все присутствующие в геноме фрагменты ДНК принадлежат хромосоме Df{l)dm75e19.

карты рестрикции, изображенной на рис. 9.18,J3, показывает, что новый фрагмент, длиной примерно в 8,8 т. п. н., должен представлять собой левую часть фрагмента длиной 9,0 т. п.н., идентифицируемого зондом XcDml570. Следовательно, крайняя точка делеций Df (1 )dm15e19 должна располагаться внутри фрагмента XcDm 1570, причем неподалеку от правого конца участка длиной 9,0 т.п.н. фрагмента Hmdlll. После того как установлено, что А.-вектор, несущий участок ДНК из хромоДополнение 9.2. Сколь велика библиотека генома ?

Число независимо клонируемых случайно выбранных фрагментов ДНК, необходимое для того, чтобы составить библиотеку генома (иногда говорят «банк генов»), зависит от размера генома организма и от величины клонируемых фрагментов ДНК.

Пусть N- число независимых клонов, составляющих библиотеку;

Р~ вероятность того, что данная ну-клеотидная последовательность представлена в библиотеке;

L~ средняя величина клонируемых фрагментов ДНК;

Х-размер данной искомой нуклеотидной последовательности;

М-размер генома.

Тогда

L-X'

М

In (1 - Р)

In 1 1 Clarke L., Carbon J. (1976). Cell, 9, 91-99.

Это выражение1 позволяет определить вероятность того, что в коллекции из N клонов представлен ген величины X. Обычно в качестве минимально приемлемого значения вероятности выбирается Р = 0,99 и разрабатывается состав реакционной смеси, гарантирующей получение числа независимых рекомбинантных векторов, превышающих данное JV.

сомы дрозофилы, включает конец делеции Df(l)dm15e19, можно начать «прогулку по хромосоме».

Делая первый шаг по хромосоме, мы используем радиоактивно меченный рестрикционный фрагмент ДНК дрозофилы в A,cDml570 в качестве зонда, позволяющего отобрать в библиотеке генов дрозофилы другие фаги, гибридизирующие с ним. При этом оказывается, что существует общий участок у векторов A,cDml570 и A,cDm2001 (рис. 9.16). Следующий шаг состоит в том, чтобы используя в качестве зонда радиоактивно меченный фрагмент рестрикции вектора XcDm2001, расположенный правде участка, общего с вектором A.cDm 1570, выбрать из библиотеки новые фаги, гибридизирующие с XcDm2001. Таким способом из библиотеки последовательностей отбирается набор фрагментов с общими участками; полученная таким образом коллекция рекомбинантных фагов дает расшифровку последовательности вправо от гена Sgs-4 (рис. 9.16). Из карт сайтов рестрикции отдельно взятых клонируемых сегментов можно собрать карту участка хромосомы в целом. Для того чтобы в процессе такой «прогулки по хромосоме» следить, в какой именно точке мы находимся, следует использовать клонируемые зонды для локализации на карте рестрикции концевых точек других хромосомных перестроек (рис. 9.18). В результате такой процесс прогулки по хромосоме может быть спроецирован на цитологическую карту, поскольку известны клоны, захватывающие концевые точки делеции Df(l)N6AjiS, Df(l)N15h24 и Df(l)N6"16.

Обзор методов работы с ДНК

«Прогулка по хромосоме»-это инструмент, позволяющий систематически картировать хромосомы эукариотических организмов. Обсуждавшиеся в этой главе методы работы с ДНК-клонирование рестрик-ционных фрагментов, анализ сайтов рестрикции в клонируемой ДНК, метод Саузерна, использование клонируемой ДНК в качестве радиоактивного зонда при гибридизации с другими фрагментами ДНК-дают возможность использовать мощные методы генетического анализа, разработанные на прокариотических организмах, для исследования генетической организации эукариот на уровне нуклеотидных последовательностей. Применение этих методов привело к колоссальному прогрессу в наших знаниях об организации, функционировании и эволюции геномов эукариот. Некоторые из этих открытий мы подробно обсудим в следующих главах, о других можно прочитать в научных журналах.

Не удивительно, что новые эффективные методы исследований нашли применение не только в фундаментальных исследованиях. Они оказывают глубокое влияние на медицину, ветеринарию, селекцию животных, растений, на микробиологическую промышленность. Приведем всего лишь несколько примеров.

Рестрикционный анализ ДНК позволяет выявить различия в отдельных нуклеотидных парах, появляющиеся в результате мутаций в сайтах, узнаваемых соответствующим ферментом. В случае серповид-ноклеточной анемии происходит замена AT на ТА в шестой паре нуклеотидов гена, кодирующего |}-цепь гемоглобина человека; замена происходит в сайте (CTNAG), чувствительном к рестриктазе Ddel (рис. 9.19). Фрагменты ДНК, возникающие под действием Ddel у здорового человека и больного серповидноклеточной анемией можно сравнить с помощью метода гибридизации по Саузерну, используя в качестве зонда радиоактивно меченную ДНК гена Р-глобина, как это показано на рис. 9.19. Таким способом можно определять присутствие вредного мутантного гена в геноме эмбриона за несколько месяцев до рождения. Для этого культивируют зародышевые клетки, взятые при амниоцентезе. ДНК этих клеток экстрагируют и подвергают анализу. Такая диагностическая процедура может производиться в тех случаях, когда существует подозрение, что оба родителя-носители вредного рецессивного гена. Следует заметить, что в большинстве случаев вредные мутации происходят вне сайтов, узнаваемых рестриктазами. Однако иногда такие мутации оказываются в хромосомах тесно сцепленными с сайтами рестрикции, что может во многих случаях использоваться в пренатальной диагностике.

Новые методы работы с ДНК позволяют также значительно усовершенствовать методы создания вакцин против различных вирусных заболеваний человека и животных. Такие новые способы, включая клонирование и определение нуклеотидной последовательности ДНК вируса, применяли при разработке вакцин против ящура-одной из наиболее распространенных в мире тяжелых болезней свиней и крупного рогатого скота. Современные вакцины, приготовленные традиционным способом, используют «инактивированные» или ослабленные препараты, которые, однако, иногда содержат патогенные вирусы, что может приводить к вспышкам болезни. Кроме того, некоторые штаммы вирусов при культивировании в лабораторных условиях не достигают конРис. 9.19. Исследование мутации серповидно-клеточной анемии на уровне ДНК. А. Нормальная и мутантная последовательности аминокислот и соответствующие им последовательности нуклеотидов в ДНК. Б. Карта сайтов рестрикции клонируемого зонда для участка гена (3-цепи гемоглобина человека. Широкой полосой изображен транскрибируемый участок ДНК, тонкой линией-нетранскрибируемый участок на 5'-конце гена. В нижней части рисунка показана локализация Drfel-сайтов на рестрикционной карте нормальной и мутант-ной форм. В. Размеры Dde I-рестриктов ДНК из нормальных клеток ((3(3) и клеток, гомозиготных по мутации

страница 49
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51

Скачать книгу "Современная генетика. Том 1" (4.74Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)