Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

положения РНК-полимеразы. Анализ микрофотографий дополнительно подтверждает сделанные на основании более строгих экспериментов выводы о колинеарности последовательностей в генах и соответствующих полипептидах.

Колинеарность генов и полипептидов (эукариоты)

Разработанные сравнительно недавно методы работы с рекомби-нантными ДНК (обсуждаемые в гл. 9) позволили сравнить нуклео-тидные последовательности индивидуальных мРНК, кодирующих некоторые известные эукариотические белки, с соответствующими фрагментами последовательностей в хромосомной ДНК. Благодаря использованию этих методов в 1977 г. было сделано сенсационное открытие. Оказалось, что внутри кодирующих областей некоторых эукариотиче-ских генов содержатся нетранслируемые фрагменты последовательности. Так, некодирующие внутренние нуклеотидные последовательности были обнаружены в структурных генах fj-цепей кроличьих и мышиных гемоглобинов, легких цепей иммуноглобулинов и куриного овальбуми-на (основного компонента яичного белка). На сегодняшний день ясно, что наличие внутренних некодирующих последовательностей является типичным, хотя и не обязательным свойством эукариотических генов. На карте структурной организации гена овальбумина (рис. 11.17) показано, как семь протяженных внутренних некодирующих участков последовательности (интронов) разделяют смысловую последовательность, кодирующую зрелую мРНК, на восемь фрагментов (экзонов).

Тысячи пар нуклеотидов (тлл)

Фланкирующие участки ДНК

Рис. 11.17. Карта структурной организации гена куриного овальбумина с указанием участков, входящих в состав зрелой мРНК, и разделяющих их некодирующих участков последовательности ДНК. Каждый из пространственно разделенных кодирующих участков ДНК может быть идентифицирован по наличию сайта узнавания для одной из рестриктаз. Помечено положение инициаторного (AUG) и терминаторного (UAA) ко-донов. (По Dugaiczyk A. et al, 1978, Nature 274, 328.)

MGSIGAASMEFCFDVFKEL

ACAUACAGC UAGAAAGCyGUAUUGCCUUUAGCAGUCAAGCUCGAAAGACAACUCAGAGUUCACCAUGGGCUCCAUCGGUGC AGCAAGCAUGGAAUUUUGOUUUGAUGUAIJUC AAGGAGCU

10 20 30 40 50 60 70 80 90 10О НО 120

KVHHANENIFYCPIAIMSALAMVYLGAKDSTRTQINKVVR

CAAAGUCCACCAUGCCAAUGAGAACAUCUUC UACUGCCCCAUUGCCAUCAUGUCAGC UCUAGCCAUGGUAUACCUGGGUGCAAAAGACAGCACCAGGACACAAAUAAAUAAGGUUGUUCG

130 14 0 150 160 170 160 190 200 210 220 230 240

FDKLPGFGDSIEA, QCGTSVNVHSSLRDrLNQITKPNDVYS

CUUUGAUAAACUUCCAGGAUUCGGAGACAGUAUUGAAGCUCAGUGUGGCACAUCUGUAAACGUUCACUCUUCACUUAGAGACAUCCUCAACCAAAUCACCAAACCAAAUGAUGUUUAUUC

250 260 270 2Э0 290 300 310 320 330 340 350 360

FSLASRLYAEERYPILPEYLQCVKELYRGGLEPINFQTAA

GUUCAGCCUUGCCAGUAGACUUUAUGCUGAAGAGAGAUACCCAAUCCUGCCAGAAUACUUGCAGUGUGUGAAGGAACUGUAUAGAGGAGGCUUGGAACCUAUCAACUUUCAAACAGCUGC

370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480

DQARELINSWVESQTNGIIRNVLQPSSVDSQTAMVLVNAI

AGAUCAAGCCAGAGAGCUCAUCAAUUCCUGGGUAGAAAGUCAGACAAAUGGAAUUAUCAGAAAUGUCCUUCAGCCAAGCUCCGUGGAUUCUCAAACUGCAAUGGUUCUGGUUAAUGCCAU

490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

VFKGLWEKAFKDEDTOAMPFRVTEQESKPVQMMYQIGLFR

UGUCUUCAAAGGACUGUGGGAGAAAGCAUUUAAGGAUGAAGACACACAAGCAAUGCCUUUCAGAGUGACUGAGCAAGAAAGCAAACCUGUGCAGAUGAUGUACCAGAUUGGUUUAUUUAG

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720

VASKASEKMKILELPFASGTMSMLVLLPDEVSGLEQLESI

AGUGGCAUCAAUGGCUUCUGAGAAAAUGAAGAUCCUGGAGCUUCCAUUUGCCAGUGGGACAAUGAGCAUGUUGGUGCUGUUGCCUGAUGAAGUCUCAGGCCUUGAGCAGCUUGAGAGUAU

730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840

INFEKLTEWTSSNVMEERKIKVYLPRMKMEEKYNLTSVLM

AAUCAACUUUGAAAAACUGACUGAAUGGACCAGUUCUAAUGUUAUGGAAGAGAGGAACAUCAAAGUGUACUUACCUCGCAUGAAGAUGGAGGAAAAAUACAACCUCACAUCUGUCUUAAU

850 860 870 880 890 900 910 920 930 940 950 960

AM'GITDVFSSSANLSGISSAESLKISQAVHAAHAEINEAG

GGCUAUGGGCAUUACUGACGUGUUUAGCUCUUCAGCCAAUCUGUCUGGCAUCUCCUCAGCAGAGAGCCUGAAGAUAUCUCAAGCUGUCCAUGCAGCACAUGCAGAAAUCAAUGAAGCAGG

970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 1080

REVVGSAEAGVDAASVSEEFRADHPFLFCIKHIATNAVLF

CAGAGAGGUGGUAGGGUCAGCAGAGGCUGGAGUGGAUGCUGCAAGCGUCUCUGAAGAAUUUAGGGC UGACCAUCCAUUCCUCUUCUGUAUCAAGCACAUCGCAACCAACGCCGUUCUCUU

1090 1100 1110 1120 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200

FGRCVSP*

С UUUGGCAGA UGUG U UUCCCC UUAAAAAGAAGAAAGC UGAAAAACUCUGUCCCUUCCAACAAGACCCAGAGCACUGUAGUAUCAGGGGUAAAAUGAAAAGUAUGUUAUCUGCUGCAUCCA

1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 1310 1320

GACUUCAUAAAAGCUGGAGCUUAAUC UAGAAAAAAAAUCAGAAAGAAAUUACACUGUGAGAACAGGUGCAAUUCACUUUUCC UUUACACAGAGUAAUACUGGUAACUCAUGGAUGAAGGC

1330 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440

UUAAGGGAAUGAAAUUGGACUCACAGUACUGAGUCAUCACACUGAAAAAUGCAACCUGAUACAUCAGCAGAAGGUUUAUGGGGGAAAAAUGCAGCCUUCCAAUUAAGCCAGAUAUCUGUA

1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1S40 1550 1560

UGACCAAGCUGCUCCAGAAUUAGUCACUCAAAAUCUCUCAGAUUAAAUUAUCAACUGUCACCAACCAUUCCUAUGCUGACAAGGCAAUUGCUUGUUCUCUGUGUUCCUGAUACUACAAGG

1570 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680

CUCUUCCUGACUUCCUAAAGAUGCAUUAUAAAAAUCUUAUAAUUCACAUUUCUCCCUAAACUUUGACUCAAUCAUGGUAUGUUGGCAAAUAUGGUAUAUUACUAUUCAAAUUGUUOUCCU

1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 1770 1780 1790 1800

UGUACCCAUAUGUAAUGGGUCUUGUGAAUGUGCUCUUUUGUUCCUUUAAUCAUAAUAAAAACAUGUUUAAGC

1810 1820 1830 1840 1850 1S60 1870

Рис. 11.18. Последовательность куриной овальбуминовой мРНК. Остатки 13-1872 присутствовали в ДНК плазмиды pOV 230; остатки 1-12 и 1731-1872 были определены непосредственно по последовательности мРНК. Звездочкой помечен овальбуминовый терминаторный кодон. Зрелый овальбумин [в структуре которого отсутствует N-конце-вой (инициаторный) метионин] имеет следующий аминокислотный состав: Ala (А) 35, Arg(R)15, Asn (N) 17, Asp (D) 14, Cys(C)6, Gin (Q) 15, Glu (E) 33, Gly (G) 19, His(H)7, lie (I) 25, Leu (L) 32, Lys (K) 20, Met (M) 16, Phe (F)20, Pro (P) 14, Ser (S) 38, Thr(T)15, Trp(W)3, Tyr(Y)10, Val(V)31. Всего 385 остатков. (Modified courtesy of J.F. Catterall and B. W. O'Malley, from L Mc. Reynolds et al, Nature 273, 723, 1978.)

Вкратце рассмотрим те методы, которые позволяют получить изображенную на рис. 11.17 картину структурной организации гена. Сначала из полисом клеток куриного яйцевода, в котором овальбумин является основным синтезируемым белком, выделяют овальбуминовую мРНК, которая содержится там в значительном количестве копий. Эта

Рис. 11.19. А. Рестрик-ционная карта участка плазмиды pOV 230, содержащего овальбуми-новую кДНК, и сопоставление с овальбуми-новой мРНК. Б. Полученные при расщеплении рестриктазами Hin-dlll и Haelll фрагменты OVL и OVR могут быть очищены с помощью электрофореза в агарозном геле. Векторная часть плаз-мидной ДНК (рМВ9) при этом расщепляется на много мелких фрагментов, мигрирующих гораздо быстрее, чем OVL и OVR. После извлечения из агарозного геля фрагменты OVL и OVR могут быть получены в чистом виде. (По Lai Е. et al. 1978. Ргос. Nat. Acad. Sci. USA, 75, 2205.)

PMB9

0,3'

№ndIII

г"

5'KОвальбуминовая мРНК

1,85

OVR 1,45 т.п.н.

OVL 1,15 тлл.

AAA

pMB9

Hae III

двух фрагментов, содержащих 1150 и 1450 нуклеотидов (рис. 11.19). Меньший фрагмент содержит кДНК, соответствующую 5'-концевому участку, а больший фрагмент - З'-концевому участку мРНК. С помощью ник-трансляции, используя ДНК-полимеразу I Е. coli (см. гл. 13) и <х-32Р-дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, в каждый из этих фрагментов можно ввести радиоактивную метку in vitro. Помеченные таким образом до очень высокой удельной активности фрагменты кДНК можно нагреванием перевести в одноцепочечную форму и использовать в качестве зондов для идентификации комплементарных фрагментов, содержащихся в денатурированной суммарной ДНК куриного генома.

Поскольку кДНК, полученная по овальбуминовой мРНК, не содержит Есо RI-сайтов, то можно было бы ожидать, что при расщеплении тотальной куриной ДНК рестриктазой EcoRl образуется только один фрагмент ДНК, содержащий последовательность, комплементарную кДНК (в куриной ДНК имеется множество сайтов для ЕсоШ, так что какие-то два из них наверняка окажутся по каждую сторону овальбуми-нового гена). Такой фрагмент может быть идентифицирован с помощью гель-электрофоретического разделения по размеру фрагментов куриной геномной ДНК, расщепленной Есо RI, денатурации фрагментов и последующей гибридизации с денатурированным меченым кДНК-зон-дом (рис. 11.20). Осуществление такого эксперимента дало весьма неожиданные результаты. Оказалось, что не один, а четыре фрагмента различной длины содержат последовательности, комплементарные тому

9,5 тля.—> Щш-Щ

4,2 1лл.—>Щ Ж

2,4 тлл. Щ & 1,8 Т.П.Н. —>S

Рис. 11.20. Изображение радиоавто-граммы, полученной после расщепления суммарной куриной ДНК ре-стриктазой ЕсоК 1, электрофоретиче-ского разделения в агарозном геле, переноса по Саузерну и гибридизации с радиоактивными зондами, полученными на основе фрагментов OVL и OVR по отдельности и в смеси. (По Lai Е. et al. 1978. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2205.)

или иному из двух кДНК-зондов (рис. 11.20). Это может означать только то, что в истинный овальбуминовый ген входят участки последовательности, содержащие сайты узнавания для EcoRl, которые не включаются в последовательность мРНК. Эти четыре Есо Rl-фрагмента отмечены на карте (рис. 11.17), построенной на основе серии аналогичных экспериментов с использованием набора различных рестриктаз для расщепления и сопоставления куриной геномной ДНК и овальбу-миновой кДНК.

До того как было открыто существование интронов, процесс образования цитоплазматических мРНК представлялся достаточно неясным. Биохимические исследования ядерной РНК показали, что в ее состав входят молекулы значительно большего размера, чем молекулы цитоплазматических мРНК. РНК этого типа называется гетерогенной ядерной РНК (гяРНК). Было обнаружено, что большая часть гяРНК не попадает в цитоплазму, а подвергается деградации до нуклеотидов непосредственно в ядре. С помощью биохимических методов не удавалось установить, синтезируются ли в ядре молекулы мРНК в том виде, в котором они обнаруживаются в цитоплазме. Можно было предположить, что в ядре их не удается обнаружить просто из-за большого избытка гяРНК. В то же время представлялось весьма ве

страница 10
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.02.2020)