Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

ейшие выводы относительно природы генетического кода, сделанные на основании описанных экспериментов, позволили построить изящную, внутренне непротиворечивую модель. Сформулированные постулаты соответствовали полученным генетическим данным, однако казалось, что их независимое экспериментальное подтверждение-дело далекого будущего. Ко всеобщему удивлению, потребовалось всего лишь пять лет для того, чтобы получить биохимические доказательства всех четырех постулатов и полностью расшифровать генетический код.

Генетическое подтверждение существования терминаторных кодонов

Изучение г//-мутаций предоставило также генетические свидетельства в пользу существования кодонов, терминирующих синтез полипептидной цепи. Комплементационный анализ показал, что цистроны А и В кодируют две различные генетические функции. Это значит, что на границе между этими цистронами должны находиться определенные генетические «знаки препинания». Делеция такого пограничного участка приводит к слиянию неделетированных участков Л и В в один общий цистрон. Так, делеция 1589 (рис. 12.2) приводит к возникновению rllA-мутанта, сохраняющего, несмотря на частичную делецию в В-цистроне, его функциональность, т.е. способность кодировать активный В-белок. Участок В-цистрона, исчезающий при делеции 1589, содержит ту самую область, в которой картируются мутации FC0 и ее производные. Это подтверждает сделанный в предыдущем разделе вывод о том, что данный участок В-белка не существен для проявления нормальной активности. Введение мутации со сдвигом рамки в неактивный Л-участок слитых цистронов, образовавшихся в результате делеции 1589, нарушает и функциональную активность В-участка. Следовательно, слитая мРНК имеет направление трансляции А В; считывание этой мРНК приводит к образованию одного слитого полипептида.

Аналоги нуклеиновых оснований, вызывающие мутации, отличные от сдвига рамки, также могут индуцировать такие мутации в Л-участке «слитого» цистрона, которые влекут за собой потерю В-функции. Некоторые из этих мутаций, которые сводятся к замещению единичных нуклеотидов, принадлежат к классу супрессируемых летальных amber-щ-таций (см. гл. 7). Возможное объяснение природы влияния amber-мута-ции в Л-участке на экспрессию В-белка могло заключаться в том, что благодаря этой мутации возникает терминаторный кодон, предотвращающий трансляцию В-участка слитой мРНК.

Прямое свидетельство в пользу того, что amber-мутации вызывают преждевременную терминацию трансляции, было получено при исслеrllA шв

Делеция

Рис. 12.2. Делеция пограничного участка, расположенного между цистронами Л и В /-//-мутанта, удаляет последовательность, необходимую для независимой экспрессии двух различных генетических элементов, и приводит к образованию слитого А-В цистрона. Отмечен размер участка, элиминируемого при делеции 1589.

ЯП С140 ?17

В 272

Мутации Н32 Й278

С137 Я36 /4 489 С 208

Фрагмент НИ

>

Фрагмент С140 Фрагмент в 17

Фрагмент в 272

Фрагмент Н32

Фрагмент В 278

Фрагмент С137

Фрагмент Н36

Фрагмент А 489

Фрагмент С 208

Полная молекула

Длина полипептидной цепи

Рис. 12.3. Расположение на генетической карте десяти amfeer-мутаций белка головки фага Т4. Внизу показана длина полипептидов, синтезируемых при абортивной инфекции каждым из соответствующих мутантов в клетках рестриктивного хозяина. Длина полипептидов непосредственно коррелирует с положением

соответствующих мутации на карте гена. Это подтверждает гипотезу, согласно которой amber-мутации обусловливают преждевременную терми-нацию белкового синтеза по мутант-ной мРНК-матрице. (По Sarabchai А. S., Stretton А. О. W., Brenner S., Bolle А. 1964. Nature 201, 13.)

довании биосинтеза белка головки фага Т4. Десять amber-мутаций, картированных в различных участках гена, кодирующего белок фаговой головки, изучали, проводя инфекцию рестриктивного хозяина и оценивая для каждого мутанта величину транслируемого участка соответствующей мРНК. Оказалось, что длина фрагмента белка фаговой головки, синтезируемого при абортивной инфекции, точно коррелирует с положением каждой из этих мутаций на карте соответствующего гена (рис. 12.3). Эти результаты свидетельствуют о том, что amber-мутации действительно вызывают терминацию трансляции, а кроме того, они еще раз наглядно продемонстрировали правильность представления о колинеарности генов и полипептидов.

Расшифровка кода с помощью биохимических методов

Первым существенным вкладом биохимии в решение проблемы генетического кода явилась разработка системы бесклеточного синтеза белка in vitro на базе белок-синтезирующего аппарата Е. coli. Синтез белка в этой системе, происходящий только в присутствии мРНК, регистрировался и оценивался по включению радиоактивных аминокислот в состав пептидов. Обычно. в каждом данном эксперименте используют только одну радиоактивную аминокислоту, а остальные 19-нерадиоактивные. Таким образом, удается оценить возможность утилизации в системе одной определенной аминокислоты.

В экспериментах с бесклеточной системой Маршалл Ниренберг и Генрих Маттэи, исследовавшие активность различных препаратов РНК в роли матриц для белкового синтеза, в качестве контроля использовали синтетическую полиуридиловую кислоту (poly U), рассчитывая, что она не будет проявлять существенной матричной активности. К своему большому удивлению, они обнаружили, что poly U достаточно эффективно направляет синтез полифенилаланина. Более того, поли-фенилаланин оказался единственным полипептидом, синтезируемым в присутствии poly U. Из этих наблюдений непосредственно вытекало, что триплет UUU служит кодовом для фенилаланина. Вскоре аналогичным образом было установлено, что poly С направляет синтез поли-пролина, а poly А-синтез полилизина, то есть ССС является проли-новым кодоном, а AAA кодирует лизин. К счастью, использованная в этих экспериментах бесклеточная система содержала повышенную концентрацию ионов магния, при которой (как выяснилось в дальнейшем) инициация синтеза полипептидной цепи происходит и в отсутствие инициаторного ко дона AUG (см. гл. 11). Только поэтому вышеупомянутые синтетические матрицы и удавалось использовать в качестве субстратов для аномальной инициации трансляции. Так, отчасти благодаря счастливой случайности, были сделаны первые шаги на пути к полной расшифровке генетического кода.

Далее последовала серия экспериментов по изучению кодирующих свойств в бесклеточной системе статистических РНК-сополимеров. Такие сополимеры можно синтезировать in vitro с помощью фермента по-линуклеотид-фосфорилазы, используя в качестве субстратов 5'-рибону-клеозиддифосфаты. Для работы этого фермента не требуется ни затравки, ни матрицы,-полимеризация идет случайно за счет присоединения нуклеотидов к З'-концу растущей цепи в соответствии с относительным содержанием различных 5'-рибонуклеозиддифосфатов в реакционной смеси. Так, если в реакционной смеси содержится ADP и CDP в соотношении 5 :1, то образующийся сополимер также будет состоять из А и С в соотношении 5:1. Распределение оснований каждого типа

в цепи будет случайным, т.е. отвечающим только его относительному содержанию в смеси. Частота возникновения кодонов различного состава в случайном сополимере с соотношением А : С = 5 :1 может быть рассчитана (табл. 12.4). Расчет показывает, что на каждые 100 кодонов AAA в сополимере должны присутствовать 60 кодонов типа 2А1С (ААС, АСА и САА) и так далее. Ввиду полярности РНК-молекул (5'-3') кодоны ААС и САА неидентичны. По установившейся традиции, при записи последовательности 5'-конец помещается слева, З'-конец-справа, поэтому приведенные выше последовательности кодонов следует понимать как сокращенные варианты записи последовательностей типа 5'-рА рАрС0Н-3' и т.п.

Относительные величины, отражающие включение отдельных аминокислот в состав полипептидов, синтезируемых в присутствии (А : С = = 5 :1)-сополимера, приведены в табл. 12.5, А. Наблюдается включение шести различных аминокислот. Наиболее часто включающуюся в полипептиды аминокислоту-лизин, как мы знаем, кодирует триплет AAA, а наименее часто встречающуюся-пролин-триплет ССС. Основываясь на расчетных данных таблицы 12.4, можно установить соответствие между определенными аминокислотами и триплетами определенного состава. Результаты аналогичного эксперимента, основанного на использовании сополимера, содержащего А и С в соотношении 1 :5, показаны в табл. 12.5, Б. Подобные эксперименты позволяют установить состав кодонов, соответствующих данной аминокислоте, однако не дают никакой информации о последовательности оснований в этих кодонах.

Одним из подходов к установлению последовательности в кодонах является использование синтетических мРНК с известной последовательностью. Например, панкреатическая рибонуклеаза (эндонуклеаза, специфичная к пиримидиновым нуклеотидам) может расщеплять сополимер с составом А : С = 25 :1 только по З'-концу остатка С с образованием молекул мРНК, имеющих общую структуру, близкую к А25С. Такая матрица направляет синтез олиголизина, содержащего на С-конце остаток аспарагина. Это свидетельствует о том, что кодон ААС соответствует аспарагину, а также доказывает, что трансляция матрицы протекает в направлении 5' -»• 3', поскольку при считывании в противоположном направлении происходил бы синтез олиголизина с N-KOH-цевым глутамином (САА).

Более систематическое определение структуры кодонов предпринял химик-органик Хар Гобинд Корана. Он разработал методы химического синтеза матриц с известной последовательностью и осуществил синтез всех 64 триплетов, которые могут входить в состав мРНК. После того как такие молекулы были синтезированы, появилась возможность окончательно определить значение всех «слов» генетического кода. Достижение этой цели удалось ускорить благодаря тому, что в присутствии некоторых тринуклеотидов происходит, как было обнаружено, специфическое связывание определенных аминоацил-тРНК с рибосомами. Взаимодействие между синтетическим кодоном и соответствующим антикодоном, входящим в состав аминоацил-тРНК, осуществляется при участии

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.10.2019)