Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

присоединиться следующий нуклеотид растущей цепи ДНК. Реакция, катализируемая ДНК-полимеразой, может быть отражена следующей схемой:

(dNp)„dN0H + dNTP - (dNp)„ + 1dN0H + Р-Р,

где (dNp)„dNOH-3TO растущая цепь ДНК с З'-ОН-группой на конце, dNTP - мо лекула дезоксирибунуклеозидтрифосфата, а Р-Р-молекула неорганического пирофосфата. Очередной нуклеотид присоединяется к З'-концу растущей цепи, при этом происходит отщепление пирофосфата. З'-ОН-группа присоединившегося таким образом нуклеотида в свою очередь выступает в роли затравки для присоединения следующего нуклеотида. Цепи ДНК в предложенной Уотсоном и Криком структуре двойной спирали антипараллельны, то есть в области репликативной вилки присутствуют и 3'- и 5'-концы синтезируемых цепей. Как уже упоминалось, для действия ДНК-полимеразы необходимо наличие З'-ОН-затравки, и поэтому только одна из двух растущих цепей ДНК [ведущая цепь) может синтезироваться непрерывно. Синтез другой (отстающей) цепи идет прерывисто (рис. 13.1, Л). Экспериментальные данные, свидетельствующие о прерывистом характере роста в репликативной вилке одной из цепей, были получены с помощью пульсового введения метки 3Н-тимидина в синтезируемую в клетках ДНК. Если перед экстракцией ДНК из клеток они находились в контакте с радиоактивным субстратом лишь в течение нескольких секунд, то оказывается, что значительная часть новосинтезированной ДНК (идентифицируемой по содержанию радиоактивности) при щелочной денатурации распадается на ряд небольших одноцепочечных фрагментов длиной около 1000-2000 нуклеотидов. Они получили название фрагментов Оказаки, по имени Рейджи Оказаки, впервые обнаружившего эту особенность репликации ДНК. Если пульсовое введение 3Н-тимидина прерывают перенесением растущих клеток на обычную среду, не содержащую меченых предшественников, и подращивают клетки в течение нескольких минут (метод «пульс-чейз»), то радиоактивность обнаруживается уже в составе весьма протяженных фрагментов ДНК (рис. 13.2).

Поначалу тот факт, что «отстающая» цепь ДНК синтезируется не непрерывно, представлялся весьма удивительным, поскольку неясно было, откуда всякий раз берутся новые затравки («праймеры»). Как известно, для работы ДНК-полимеразы необходимо наличие З'-ОН-затравки, без которой фермент не способен направлять рост цепи. Так, очищенная ДНК-полимераза оказывается абсолютно неактивной в смеси, содержащей кольцевую одноцепочечную ДНК фага фХ174 в качестве матрицы и необходимые субстраты. В то же время, как мы знаем, РНК-полимераза может инициировать синтез РНК по одноцепочечной ДНК-матрице в отсутствие какой бы то ни было затравки.

Это свойство РНК-полимеразы подтверждается, как отмечалось в гл. 11, тем, что на 5'-конце синтезируемых молекул РНК содержится трифосфатная группировка. Впоследствии было установлено, что на 5'-конце фрагментов Оказаки находятся участки РНК. Это указывает на участие РНК-полимеразы в образовании РНК-затравок при репликации

3'

Следующий цикл

>

5 ДНК-лигаза зашивает одноце-почечный разрыв

В

J9*

Топоизомераза

5' 3'

РНК-затравочный участок одного фрагмента ДНК удаляется после того, как завершается синтез следующего фрагмента. Разрыв между двумя фрагментами закрывается благодаря действию ДНК-лигазы. В. Участие хе-ликазы, SSB-белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК, и топоизомеразы в расплетании двойной спирали родительской ДНК при движении репликативной вилки. {По Alberts В., Sternglanz R, 1977. Nature, 269, 655.)

ми. Небольшие фрагменты, содержащиеся в пике, расположенном в верхней части центрифужной пробирки, через некоторое время после удаления из среды радиоактивных предшественников (период «чейз») оказываются включенными в состав Протяженных одноцепочечных участков (цветная линия). Разделение основано на том, что большие по размеру одноцепочечные цепи характеризуются более высокой скоростью седиментации, чем небольшие фрагменты.

ДНК. Эту РНК-полимеразу, отличающуюся от ферментов, которые непосредственно участвуют в процессе транскрипции, называют прайма-зой.

РНК-затравочные участки не сохраняются в структуре зрелой ДНК. После реализации своей функции для инициации репликации ДНК они удаляются за счет проявления 5' З'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы (рис. 13.1, Б и 13.3). После удаления РНК-затравки и ее замещения на фрагмент ДНК, инициация синтеза которого происходит на следующей РНК-затравке, расположенной ближе к области репликативной вилки, между двумя соседними синтезированными фрагментами ДНК остается разрыв. Этот разрыв (отсутствие ковалентной связи между З'-ОН- и 5'-Р04-концами фрагментов цепи) устраняется при участии фермента-ДНК-лигазы,-направляющего образование фосфоди-эфирной связи (рис. 13.4).

Синтез ведущей и отстающей цепей происходит по мере продвижения репликативной вилки вдоль двойной спирали родительской ДНК (см. рис. 13.1). Процесс расплетания двойной спирали и экспонирования

5' 3'У

/ШШШЦШ111^^

5'

Праймаза

Синтез РНК-затравки в направлении 5' -* З'с последующей диссоциацией праймазы

5' Г

pppwinrirfitiҐ

Рис, 13.3. Синтез отстающей цепи ДНК инициируется праймазой, при действии которой образуются короткие РНК-фрагменты, комплементарные соответствующим участкам матричной цепи ДНК. З'-ОН-концы этих фрагментов выступают в качестве затравки для синтеза ДНК, направляемого ДНК-полимеразой III. ДНК-полимераза I удаляет РНК-затравку, начиная с 5'-конца. При этом

З'-ОН-конец предшествующего фрагмента цепи ДНК служит затравкой для проявления 5' -* З'-экзонуклеазной активности (удаление РНК) и поли-меразной активности (заполнение бреши) ДНК-полимеразы I. После замены участка РНК на соответствующий участок ДНК между двумя соседними фрагментами цепи ДНК остается разрыв, который закрывается ДНК-лигазой.

двух матричных цепей ДНК происходит при участии трех типов белков (см. табл. 13.1) и сопровождается значительными энергетическими затратами. Белок первого типа, хеликаза, осуществляет собственно расплетание спирали, а необходимая для этого энергия поставляется за счет гидролиза АТР. Белок второго типа (SSB) специфически связываетЕ + 1У"1/'ГП — Е-АМР+Никотинамидмононуклеотид(ММР) AMP

Е-АМР +

3'

О 11

он /\"о^О О- 5'

3'

О II

о о5'

+ ЕО-Р=О

Аденозин

3'

О

II

о о-IО-Р=О

5'

з'

О

и роО5'

AMP

Аденозин

Рис. 13.4. ДНК-лигаза (Е) «зашивает» одноцепочечный разрыв в цепи ДНК, используя энергию, поставляемую за счет гидролиза никотинамидаденин-динуклеотида (NMP-PMA). Реакция протекает через образование промежуточного комплекса фермент—AMP. Остаток AMP переносится на 5'-фосфатную группу в месте разрыва. Образовавшийся дифос-фатный остаток гидролизуется за счет атаки З'-ОН-группы следующего нуклеотида с образованием ковалент-ной фосфодиэфирной связи. ДНК-лигаза фага Т4 для образования интер-медиата (фермент-AMP) вместо ни-котинамидадениндинуклеотида предпочтительно использует АТР.

ся с одноцепочечной ДНК, предотвращая преждевременную реассоциа-цию цепей. Расплетание двойной спирали родительской ДНК без вращения приводит к образованию дополнительных витков или узлов на участках ДНК впереди репликативной вилки, аналогичных узлам, которые возникают при быстром разъединении скрученных нитей волокна. Белок третьего типа, топоизомераза, способствует релаксации сверх-скрученных участков ДНК, внося одноцепочечные разрывы фосфоди-эфирных связей и раскручивая узлы в области родительской двойной спирали перед репликативной вилкой. После такого раскручивания и снятия напряжения, связанного с образованием дополнительных витков спирали, топоизомераза вновь замыкает разорванные фосфоди-эфирные связи и восстанавливает структурную целостность родительской ДНК. Схема действия трех названных белков в процессе репликации представлена на рис. 13.1, В.

Генетический анализ репликации ДНК

Генетический анализ, который сыграл весьма существенную роль в изучении энзимологии и молекулярного механизма процесса репликации ДНК, основан на выделении и исследовании мутантов, характеризующихся либо полной утратой, либо повреждением той или иной сущео

15 30 45 60

Время (мин) при 42,5"

Рис. 13.5. А. Включение 3Н-тимина (черные кружки) и 14С-лейцина (цветные кружки) в клетки температурочувствительного мутанта dnaE при рестриктивной температуре. После температурного сдвига до 42,5° синтез ДНК практически немедленно прекращается, в то время как синтез белка продолжается с нормальной скоростью. Сравните это с поведением клеток температурочувствительного мутанта dnaA (включение 3Н-тимина-черные квадратики; включение 14С-лейцина-цветные

квадратики), которые в течение 15 мин после повышения температуры до 42,5° продолжают синтезировать ДНК. (По Wechsler J. А., Gross J. D., 1971. Molec. Gen. Genetics, 113, 273.) Б. На приведенной диаграмме проиллюстрированы различия между процессами инициации и элонгации при репликации хромосомы Е. coli. Мутация dnaE затрагивает элонгацию, а мутация dnaA -инициацию репликации.

Рис. 13.6. Положение генов, вовлеченных в синтез ДНК, на хромосоме Е. coli.

dnaC

WBK 100/0 ' 1 f'-}^^/ineZ

SO

Л

„7

4'J

У

Локус Функция

polB ДНК-полимераза II

dnaE Субъединица ДНК-полимеразы III

dnaX Субъединица ДНК-полимеразы III

dnaZ Субъединица ДНК-полимеразы III

dnal Инициация репликации ДНК

дуг A Субъединица ДНК-гиразы(топоизомеразы II)

Ug ДНК-лигаза

Ana G Праймазная субъединица праймосомы

дуг в Субъединица ДНК-гиразы(топоизомеразы II)

dnaA Инициация репликации ДНК

ori С Участок инициации репликации ДНК

dnaP Инициация репликации ДНК

polA ДНК-полимераза I

rpoB Субъединица РНК-полимеразы

dnaB Субъединица праймосомы

ssb SSB-белок, связывающийся с одноцепочечной

ДНК

dna С Субъединица праймосомы

ственной генетической функции. Некоторые мутации такого рода сопровождаются изменениями, затрагивающими уже идентифицированные ферменты. Другие позволяют идентифицировать новые ферменты. Если данная мутация является летальной или условно-летальной, то затрагиваемая ею функция, вероятно, играет важную роль в изучаемом процессе.<

страница 23
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)