Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

pol II (например, мутация polB полностью выводит из строя этот фермент), показало, что активность этой ДНК-полимеразы не является жизненно важной; ее непосредственная функциональная роль в клетке не установлена. С другой стороны, генетический анализ продемонстрировал, что присутствие Pol III необходимо для синтеза ДНК в репликативной вилке. ДНК-полиме-раза III-это полисубъединичный фермент, субъединицы которого кодируются жизненно важными генами dnaE, dnaX и dnaZ, а также некоторыми другими, еще не идентифицированными генами. Этот фермент необходим для синтеза как ведущей, так и отстающей цепей ДНК. При синтезе отстающей цепи Pol III использует РНК-затравки, синтезируемые праймазой, которую кодирует жизненно важный ген dnaG.

Биохимический анализ механизма репликации ДНК основан на выделении и очистке ферментов и других белков, осуществляющих одну или несколько стадий репликационного процесса in vitro. Разработке и изучению системы репликации in vitro в значительной мере способствовало использование в качестве матриц небольших подробно охарактеризованных вирусных геномов, например фага фХ174, поскольку продукты их репликации in vitro также легко поддаются изучению. Образование способных к инфекции молекул вирусной ДНК in vitro может лежать в основе однозначного биологического теста на аутентичность продукта репликации. Системы репликации in vitro были разработаны для одноцепочечных кольцевых ДНК фагов фХ174, G4 и М13. Благодаря этим исследованиям удалось сделать весьма примечательное наблюдение, что эти фаги, каждый из которых может инфицировать Е. coli, используют для своей репликации различные наборы генетических функций Е. coli, связанных с синтезом хозяйской ДНК. На ДНК М13, окруженной SSB-белками, инициация синтеза комплементарной цепи ДНК зависит от синтеза РНК-затравки в определенном участке кольца, направляемого РНК-полимеразой хозяина, которая в норме отвечает за транскрипцию хозяйской ДНК. РНК-полимеразу ингибирует антибиотик рифампицин, который подавляет также репликацию ДНК фага М13 in vitro и in vivo. С другой стороны, ДНК фага G4, также связанная с SSB-белком, для синтеза инициирующей РНК-затравки использует другой фермент клетки-хозяина-праймазу (продукт гена dnaG). В то же время для синтеза РНК-затравки и инициации репликации ДНК фага фХ174, связанной с SSB-белком, требуется участие целого ряда хозяйских белков, включая и продукты генов dna В и dna С. Во всех трех случаях синтез ДНК на образовавшейся РНК-затравке инициируется ДНК-полимеразой III. По-видимому, в репликации фХ174 участвуют все ферменты хозяина, связанные с синтезом отстающей цепи ДНК в репликативной вилке, а в случае фагов G4 и М13 необходимым является участие тех ферментов, которые используются только для инициации репликации хромосомы.

Совокупность процессов, связанных с синтезом ДНК в репликативной вилке, схематически представлена на рис. 13.10. Для образования вилки фермент хеликаза разделяет цепи родительской ДНК. В этом процессе участвует также топоизомераза, релаксирующая возникающие при расплетании дополнительные витки. С открывшимися одноцепо-чечными участками ДНК связываются молекулы SSB-белка. Синтез ведущей цепи направляется ДНК-полимеразой III. Синтез затравочных фрагментов (праймеров), необходимых для образования отстающей цепи, осуществляется сложным ферментативным комплексом, который называют праймосомой, функционирующим в тесном контакте с хелика-зоЙ, В состав праймосомы входят продукты генов dna В, dna С и dnaG, а также еще четыре белка - продукты неидентифицированных генов п, п', п" и i. Вероятно, большая часть этих белков используется для удаления молекул SSB-белка и экспонирования участка, на котором праймаза (dna G) может инициировать синтез затравки. По мере расплетания родительской двойной спирали праймосома вместе с хеликазой активно продвигаются по цепи. Для осуществления этого процесса требуется затрата энергии, поставляемой за счет гидролиза АТР белком п'. РНК-затравки необходимы для инициации синтеза ДНК ферментом Pol III. Удаление затравок реализуется за счет 5' -> З'-экзонуклеазной активно

сти ДНК-полимеразы I, которая благодаря своей полимеразной активности может также участвовать в заполнении брешей, возникших после удаления затравочных фрагментов. Остающиеся после этого 3'-ОН/5'-Р04-одноцепочечные разрывы зашиваются ДНК-лигазой, которая, таким образом, завершает образование непрерывного сахарофос-фатного остова отстающей цепи.

ной последовательностью, обозначаемых ori (от англ. origin -начало). В большинстве прокариотических геномов содержится по одному участку ori, а в значительно превышающих их по размеру эукариотических хромосомах имеется, как правило, целый ряд таких участков (см. рис. 4.24). При инициации репликации ДНК обычно возникают две ре-пликативные вилки, продвигающиеся в противоположных направлениях от точки инициации. Биохимические детали механизма инициации репликации хромосомы Е. coli изучены достаточно слабо. С помощью генетического анализа удалось обнаружить, что для инициации репликации необходимо участие продуктов генов dnaA, dnal и dnaP, а также генов дуг А и дугВ, кодирующих субъединицы топоизомеразы П. Кроме того, при инициации или сразу после нее требуется наличие ДНК-полимеразы III и продуктов генов dnaB и dnaC, вероятно, для того, чтобы начать полимеризацию в новообразовавшейся репликативной вилке. Инициация синтеза ДНК ингибируется рифампицином, что указывает на возможное участие РНК-полимеразы, отличной от собственно прай-мазы. Однако какова именно роль РНК-полимеразы в этом процессе— неизвестно.

Недавно с помощью методов генной инженерии были сконструиро

ваны небольшие плазмиды, репликация которых зависит от встроенного в них участка ori из хромосомы Е. coli. Используя эти плазмиды, можно будет создать систему инициации репликации in vitro, включающую продукты генов dnaA, dnal и dnaP, с помощью которой, вероятно, удастся изучить детали механизма инициации.

До сих пор наиболее подробно процесс инициации репликации был изучен на двухцепочечной ДНК фага фХ174. Образование такой формы из одноцепочечной геномной ДНК происходит вскоре после инфекции и зависит только от клетки-хозяина, в частности от рассмотренного выше функционирования праймосомы. Однако последующая репликация двухцепочечной кольцевой ДНК и образование одноцепочечных колец, входящих в состав дочерних фаговых частиц, зависит уже от действия

белка, кодируемого фаговым цистроном А, а также от праймосомы, хе-ликазы, топоизомеразы и ДНК-полимеразы I клетки-хозяина. Белок, продукт cis А, является эндонуклеазой, узнающей участок ori на ДНК фХ174 (расположенный внутри самого цистрона А) и вносящей разрыв в (+ )-цепь. Таким образом, возникает З'-ОН-затравка, на которой инициируется репликация по механизму катящегося кольца, направляемого ДНК-полимеразой III. Одна из двух идентичных субъединиц димерного белка cis А образует ковалентную связь с 5'-Р04-концом одноцепочеч-ного разрыва. По окончании одного цикла репликации (рис. 13.11) образуется двухцепочечная кольцевая ДНК, содержащая новообразованную ( + )-цепь, связанную с белком cis А, и отделяется дочерняя одноцепочеч-ная фаговая ДНК. Ковалентное замыкание этой одноцепочечной ДНК в кольцо осуществляется самим белком cis А. Интересно отметить, что подобно тому, как у фага фХ174 участок ori находится внутри гена А, так и у фага А, участок ori находится внутри последовательности гена О, кодирующего белок, необходимый для репликации фаговой ДНК.

Неизвестно, насколько универсален описанный механизм инициации репликации, основанный на действии оп-специфичной эндонуклеазы. Участие в инициации репликации хромосомы Е. coli топоизомеразы II (ДНК-гиразы) позволяет предположить возможность существования альтернативного механизма инициации, не связанного с участием особой эндонуклеазы. ДНК-гираза направляет АТР-зависимый процесс расплетания двойной спирали, вводя отрицательные супервитки. Это может приводить к необходимому экспонированию матричных нитей без внесения одноцепочечного разрыва в точке начала репликации.

Синтез ДНК у эукариот

Подходы, разработанные при изучении процесса синтеза ДНК в прокариотических клетках, были применены и для анализа репликации эукариотических ДНК. Знание типов генетических функций, необходимых для репликации прокариотических ДНК, способствовало выявлению с помощью биохимического анализа сходных функций и в эукариотических клетках. Геномы вирусов эукариот, такие, как двухцепочечная кольцевая ДНК вируса SV40, послужили удобной моделью для изучения эукариотических репликативных функций, подобно тому как небольшие фаговые геномы оказались весьма полезными для анализа процесса репликации у Е. coli. До настоящего времени генетический анализ процесса репликации у эукариот не играл столь существенной роли, как это было в случае прокариот.

В эукариотических клетках были обнаружены три вида ДНК-поли-меразной активности. Фермент Poloc служит основной полимеразой, вовлеченной в синтез ДНК в репликативной вилке. Фермент Ро1р\, судя по всему, участвует главным образом в репарационных процессах, a Poly-это единственная полимераза, обнаруженная в митохондриях, используемая, вероятно, для репликации митохондриального генома. Для функционирования всех трех видов полимераз требуется наличие З'-ОН-затравочного конца. Было показано также участие РНК-затравок в репликации эукариотических ДНК. В то же время были выявлены весьма существенные различия в том, как прокариотические и эукарио

тические ДНК-полимеразы осуществляют процесс исправления ошибок репликации (см. следующий раздел). В эукариотических клетках были обнаружены и выделены в чистом виде ферменты, обладающие хеликаз-ной и топоизомеразной активностями, а также белки, специфически связывающиеся с одноцепочечными участками ДНК. Несмотря на отсутствие исчерпывающей информации о протекании процессов синтеза ДНК, есть все основания полагать, что они в основных чертах являются общими как для прокариотических, так и для эукариотических клеток.

Точность синтеза ДНК

Частота ошибочного

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(06.12.2019)