Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

включения нуклеотидов в новообразующуюся при репликации цепь ДНК, порождающая спонтанные мутации, крайне низка (10~8-10~ 10). В то же время на основании физико-химического рассмотрения специфичности образования системы водородных связей между основаниями может быть предсказана значительно более высокая частота ошибочного включения - вплоть до Ю-2. Таким образом, в обеспечении точности репликации ДНК помимо непосредственного образования водородных связей между комплементарными основаниями участвуют и дополнительные факторы контроля. Некоторые из этих дополнительных факторов, как оказалось, обусловлены функциональными особенностями самих полимераз.

Изучение ДНК-полимеразы I Е. coli позволило выявить три фактора, вносящие вклад в обеспечение точности функционирования этого фермента. Считают, что при подходе и связывании очередного дезоксири-бонуклеозидтрифосфата с трифосфатным центром (рис. 13.7) фермент осуществляет контроль общего размера новой пары оснований, возникающей при взаимодействии с основанием в матричной цепи, прежде чем запустить реакцию полимеризации. Только благодаря такому контролю частота возникновения ошибок снижается до 10"4-10-5. Связавшийся нуклеотид затем перемещается к центру связывания концевого участка затравки, где вновь происходит проверка правильности образования водородных связей между основаниями. Для образования ковалентной связи с З'-ОН-группой концевого нуклеотида растущей цепи необходимо наличие правильной системы водородных связей, обеспечиваемой комплементарными взаимодействиями между основаниями. В случае ошибочного включения неправильного нуклеотида дальнейшая полимеризация блокируется и активируется присущая ферменту 3' -»? -> 5'-экзонуклеазная активность. Происходит вырезание ошибочно включенного нуклеотида, фермент перемещается назад так, что в центр концевого участка затравки попадает предыдущий нуклеотид, после чего полимеризация продолжается обычным путем. Таким образом, правильность каждого включающегося в растущую цепь нуклеотида проверяется дважды. 3' -»? 5'-экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы при этом осуществляет корректорскую функцию {proofreading). Если каждый этап проверки снижает частоту возникновения ошибок на два порядка (10 ~2), то при реализации двух независимых этапов проверки частота возникновения ошибок уже будет оцениваться величиной Ю-4. Исследование точности репликации ДНК фага фХ174 in vitro ДНК-по-лимеразой I, с использованием в качестве теста - определения инфекционной способности образующихся молекул ДНК, выявило возникно

вение ошибок с частотой около 10 ~6, очень близкой к величине, предсказанной на основании подобных расчетов (10 _ 2 • 10 " 2 • 10 ~ 2). Добавление к реакционной смеси очищенного SSB-белка понижало частоту возникновения ошибок еще в 10 раз.

ДНК-полимераза III Е. coli также обладает 3' -»? 5'-экзонуклеазной активностью, придающей ферменту дополнительную корректорскую функцию. При использовании этого фермента для репликации ДНК фага фХ174 в системе in vitro, подобно тому как это показано на рис. 13.11, частота возникновения ошибок оценивается величиной 5-10" 1. Существенно отметить, что даже такая низкая величина намного превышает реальное значение частоты возникновения ошибок при синтезе ДНК Е. coli in vivo (10" 8-10" 10). Наблюдаемая повышенная точность процессов, протекающих in vivo, обусловлена существованием дополнительных репарационных функций, которые обсуждаются в следующем разделе.

Эукариотические ДНК-полимеразы не обладают 3' -* 5'-экзонуклеазной активностью и обусловливают гораздо более высокую частоту возникновения ошибок при репликации ДНК фага фХ174 in vitro. При одинаковых условиях для эукариотических полимераз наблюдались следующие частоты: 3-10" 5 для ДНК-полимеразы a (Pol ос), 1,2-3,0- Ю-4 для ДНК-полимераз р и у. Очевидно, что для обеспечения необходимой точности репликации в эукариотических клетках должны присутствовать дополнительные ферменты, повышающие точность этого процесса. Некоторые биохимические данные свидетельствуют о наличии у эукариот фермента с 3'-* 5'-экзонуклеазной активностью, действующего в контакте с ДНК-полимеразой а. Этот фермент может обеспечивать корректорскую функцию in vivo, утрачиваемую в ходе очистки ДНК-полимеразы а.

Можно думать, что эволюция системы коррекции и других вариантов исправления ошибок репликации сделала возможным использование РНК в качестве затравки для обеспечения механизма синтеза отстающей цепи ДНК. Способность РНК-полимеразы синтезировать цепь de novo без какой бы то ни было затравки, вероятно, сопряжена с более высокой частотой возникновения ошибок, чем в случае ДНК-полимераз, способных функционировать только при наличии затравки. Удаление потенциально ошибочной РНК-затравки 5' З'-экзонуклеазами и ее замещение на ДНК, являющуюся объектом тщательного контроля и коррекции, устраняют проблему возникновения ошибок, связанную с инициацией синтеза de novo.

Исправление ошибок репликации и репарация ДНК

Несмотря на корректорские функции, присущие ДНК-полимеразам Е. coli, некоторые нуклеотиды оказываются все же ошибочно включенными в новообразованную цепь ДНК. Их присутствие делает возможным возникновение спонтанных мутаций, в том случае если ошибки не будут исправлены до начала следующего цикла репликации. Свидетельства в пользу существования пострепликационных систем исправления ошибок, или репарации, были получены при изучении таких явлений, как

генная конверсия и высокая отрицательная интерференция, связанных с рекомбинационными процессами (см. гл. 14). Дополнительные данные были получены благодаря обнаружению мутаций, инактивирующих ферменты, вовлеченные в систему исправления ошибок репликации. Эти мутации заметно повышают частоту спонтанных мутаций во всех генах организма. Наиболее полно система исправления ошибок репликации изучена у Е. coli.

Для нормального функционирования аппарата исправления ошибок, связанных с включением неправильных нуклеотидов, необходимо располагать механизмом, позволяющим отличать новосинтезированную цепь ДНК от родительской матричной цепи. В противном случае с вероятностью 1/2 будет происходить «исправление» нуклеотида в родительской цепи, приводящее к закреплению потенциально мутагенной ошибки, допущенной ДНК-полимеразой. Вероятно, для установления различий между родительской и дочерней цепями ДНК в Е. coli используется метилирование аденина в последовательности GATC. Эта палиндром-ная последовательность обычно метилирована в обеих цепях родительской ДНК. При полуконсервативной репликации метилированной ДНК образуется дочерняя ДНК, в которой одна цепь, пришедшая от родительской ДНК, метилирована, а новообразованная цепь в течение некоторого времени после выхода из области репликативной вилки остается неметилированной. Следует заметить, что метилирование новообразованной цепи ДНК осуществляется ферментом, отличным от метилаз, входящих в систему рестрикции—модификации, обсуждавшуюся в гл. 9. Бактерии dam ~, дефектные по метилированию аденина в результате нарушения синтеза соответствующей метилазы характеризуются повышенной частотой спонтанных мутаций, что подтверждает гипотезу об участии метилазы dam в системе исправления ошибок репликации.

Система исправления ошибок в ДНК включает несколько различных ферментативных функций. Процесс исправления начинается с вырезания участка новообразованной цепи, содержащей неправильно встроенный нуклеотид, за которым следует заполнение образовавшейся бреши в ходе репарационного синтеза с использованием в качестве матрицы верной нуклеотидной последовательности родительской цепи. Было установлено участие в процессе вырезания четырех генов, точная функциональная роль каждого из которых пока неизвестна. Мутации в любом из этих генов (mutH, mutL, mutS и uvrD) вызывают проявление «мута-торного» фенотипа. Локализация этих генов на генетической карте Е. coli показана на рис. 13.12. Полной инактивации системы исправления ошибок, описанной выше, можно достичь совмещением мутаций в этих генах в пределах одного и того же штамма Е. coli. Такой штамм характеризуется частотой спонтанных мутаций около 10 _ 6—10 — 7 ошибок на нуклеотид, т.е. такой же величины, что и при действии ДНК-полимеразы III in vitro. Таким образом, крайне низкий уровень спонтанных мутаций, наблюдаемый в норме у Е. coli, обусловлен действием корректирующих функций ДНК-полимераз I и III, которые дополнительно подстрахованы системой исправления ошибок в новообразованной цепи ДНК.

Помимо ошибок, возникающих при репликации, ДНК также подвержена повреждениям, которые могут возникать спонтанно или под воздействием особых условий окружения. Для инициации удаления поврежденных нуклеотидов используются два основных типа репарационных

Рис. 13.12. Локализация генов Е. coli, уча ствующих в исправле нии ошибок репликации и репарации

polA uvrD

4/

лmutL* uvr А. \

9C

100/0

? uvrB

Рис. 13.13. Образование тиминовых диме-ров в одной из цепей ДНК включает формирование циклобутано-вого кольца (состоящего из четырех углеродных атомов) при взаимодействии атомов соседних пиримиди-новых оснований.

рис. 13.12. Репарационная эндонуклеаза вносит одноцепочечный разрыв фосфодиэфирной связи 3'-ОН/5'-Р04 со стороны 5'-конца рядом с поврежденным участком. Далее за счет действия 5' -*? З'-экзонуклеазной активности, например ДНК-полимеразы I, происходит вырезание поврежденного участка. Брешь заполняется ДНК-полимеразой I, выступающей в роли репарационной полимеразы (рис. 13.14).

Другой тип репарационных процессов основан на действии фермента, называемого ДНК-гЧ-гликозилазой. Этот фермент узнает поврежденное основание и расщепляет его N-гликозидную связь с остатком дезоксирибозы в сахарофосфатном остове цепи ДНК. Таким образом, имеет место локальная апуринизация или апиримидинизация; возникает так называемый АР-сайт, узнаваемый АР-специфической эндонуклеазой, которая расщепляет фосфодиэфирную связь рядом с АР-сайтом (рис. 13.15). Остающийся на 5'-конце одноцепочечного разрыва остаток дезоксирибозы удаляется экзонуклеазой III (продук

страница 26
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)