Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

т гена xthA), а брешь заполняется с помощью обычного репарационного синтеза. В бактериальных и эукариотических клетках был обнаружен целый ряд различных N-гликозилаз. Один из ферментов этого типа узнает неправильную пару dG/dU, возникшую в результате спонтанного дезаминирова-ния остатка dC из пары dG/dC. Дезаминирование цитозина может привести при репликации к возникновению мутантной нуклеотидной пары dA/dT, поскольку с точки зрения образования водородных связей урацил ведет себя аналогично тимину. Этот фермент -урацил-ДНК-гли-козилаза в Е. coli кодируется геном ипд. Мутации в этом гене лишают клетку способности исправлять повреждения описанного типа, что поРис. 13.14. Этапы вырезания и репарации поврежденного участка молекулы ДНК._-—_—_——И у у1 Пиримидиновый

u U ^ЩЩг U " димер искажает

nMFInilnr^fin структуру ДНК

? Репарационная

TJ У U ^ у TJ О у эндонуклеаза

JUL поврежденную

цепь

.„., „...,. ? ?. ц I Репарационная

у U U эксцизия при

гаППпППг.пПП действии

~ экзонуклеазы

Репарационный синтез

I и ы'и и и у и'и и'

разрыв

вышает частоту возникновения мутаций в 5 раз (рис. 13.15). Другие N-гликозилазы проявляют специфичность к повреждениям, вызванным действием алкилирующих агентов, таких, как сильный канцероген -ди-метилнитрозамин. Известны также N-гликозилазы, ответственные за репарацию тиминовых димеров, образование которых индуцируется ультрафиолетовым излучением.

Некоторые люди, гомозиготные по мутантному гену, вызывающему пигментную ксеродерму (Xeroderma pigmentosum), обладают повышенной чувствительностью к солнечному свету, склонны к аномальной пигментации кожи и подвержены заболеванию раком кожи. Известно несколько различных генетических форм этой болезни, и по крайней мере некоторые из них связаны с неспособностью клеток к вырезанию тиминовых димеров.

Рис. 13.15. Удаление поврежденного основания при действии ура-цил-ДНК-гликозилазы и АР-эндонуклеазы сопровождается в дальнейшем репарационным синтезом ДНК с использованием в качестве матрицы комплементарной цепи (не показана).

С А Т С G

j^PvKj^PvK

С А Т U G

CAT G

Деза минирование

Расщепление

О гликозидной связи

С A T С G

^pj^P,

Цитирование

(устранение

разрыва)

Каждый день появляются все новые данные, свидетельствующие о большом разнообразии систем репарации ДНК, функционирующих как в прокариотических, так и в эукариотических клетках. Эволюция этих систем несомненно обусловлена особым значением метаболических путей, обеспечивающих сохранность и точность передачи наследственной информации. В то же время ясно, что никакая система передачи информации не может быть совершенной и допускает возникновение мутаций, которые могут выступать в роли «сырья» для естественного отбора.

Литература

Alberts В., Sternglanz R. (1977). Recent excitement in the DNA replication problem, Nature, 269, 655-661.

Aral К-I., Kornberg A, (1979). A general priming system employing only dnaB protein and primase for DNA replication, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4308-4312.

Aral K.-I., Aral N., Shlomai J., КотЬекд A. (1980). Replication of duplex DNA of phage cpX174 reconstituted with purified enzymes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 3322-3326.

Ami K.-I., LowR.L., Kornberg A. (1981). Movement and site selection for priming by the primosome in phage Fersht A. R. (1979). Fidelity of replication of phage фХ174 DNA by DNA polymerase III holoenzyme: spontaneous mutation by misincorporation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4946-4950.

Grickman B. W., Rodman M. (1980). Escherichia coli mutator mutants deficient in methylationinstructed DNA mismatch correction, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1063-1067.

KaguniJ.M., Fuller R.S., Kornberg A. (1982). Enzymatic replication of E. coli chromosomal origin is bidirectional, Nature, 296, 623-627.

Kornberg A., 1980. DNA Replication, W.H. Freeman, San Francisco.

KunkelT.A., LoebLA. (1981). Fidelity of mammalian DNA polymerases, Science, 213, 765-767.

Lehman I. R. (1974). DNA ligase: structure, mechanism, and function, Science, 186, 790-797.

Lehman I. R., UyemuraD.G. (1976). DNA polymerase I: essential replication enzyme, Science, 193, 963-969.

Shlomai J., Kornberg A. (1980). An Escherichia coli replication protein that recognizes a unique sequence within a hairpin region in Wechsler J. A., Gross J.D. (1971). Escherichia coli mutants temperature-sensitive for DNA synthesis, Mol. Gen. Genet., 113, 273-284.

Ключевые слова и понятия

Белок, связывающийся

с одноцепочечной ДНК (SSB-белок) Ведущая цепь Гены dna

ДНК-К-гликозилаза ДНК-лигаза

ДНК-полимеразы а, р и у ДНК-полимеразы I, II и III (Poll, РоШ,

PolIII) Затравка (праймер) Исправление ошибок репликации Одноцепочечный разрыв Отстающая цепь ori (точка начала репликации)

Праймаза Праймосома

Пятнистая ксеродерма (Xeroderma

pigmentosum) Репарационная эндонуклеаза Репарация ДНК Топоизомераза Фрагменты Оказаки Хеликаза

Экзонуклеазная активность

5' -> 3'

3' -> 5' Эксцизионная репарация

Задачи

13.1. Перечислите основные отличия ДНК-полимераз и РНК-полимераз. Каковы общие свойства этих ферментов?

13.2. Объясните, каким образом генетический анализ можно использовать для изучения этапов сложного биохимического процесса.

13.3. Выделены три некомплементи-рующие температурочувствительные мутации по инициации репликации ДНК у Е.

coli. Клеточные экстракты каждого из трёх мутантных штаммов проверяли на способность направлять синтез комплементарных цепей по одноцепочечной кольцевой ДНК-матрице in vitro. На основании данных, приведенных в таблице (« + » означает протекание репликации), определите, в каких генах могут локализоваться рассматриваемые мутации. Предскажите характер поведения клеточных экстрактов двойных мутантов wz, xz, wx.

Клеточный экстракт ДНК-матрица

ФХ174 G4 М13

Мутант w — — —

Мутант х — + +

Мутант z + + —

13.4. Как, располагая температурочув-ствительной мутацией, блокирующей синтез бактериальной ДНК при рестриктивной температуре, определить, затрагивает ли она процесс элонгации цепи ДНК в репликативной вилке или инициацию синтеза ДНК на участке оп?

13.5. Изобразите предполагаемую кинетику включения 3Н-тимина в ДНК до и после изменения температуры от 30° до 42° при культивировании температурочув-ствительных мутантов Е. coli, содержащих мутации: (а) в гене dna Л и (б) в гене dna Е. Известно, что рифампицин ингибирует РНК-полимеразу. Изобразите ожидаемый кинетический профиль включения 3Н-тимина в ДНК до и после добавления рифампицина к культуре Е. coli дикого типа.

13.6. Объясните, почему нормальная система исправления ошибок репликации Е. coli вызывает повышение частоты возникновения мутаций у штаммов dam ~ ?

13.7. Фаг X дикого типа неспособен формировать бляшки на газоне мутантных штаммов Е. coli dna В ', dna С ~, dna Е ~, dna G ~ при рестриктивной температуре. В то же время фаг Т7 дикого типа способен нормально развиваться на всех этих хозяевах при рестриктивной температуре. Какой вывод можно сделать о структуре генома этих двух типов фагов?

13.8. Предложите метод, с помощью которого можно определить, играет ли В-белок существенную роль в репликации ДНК Е. coli или участвует только в репликации одноцепочечной фаговой ДНК.

13.9. Опишите два различных способа, которые могут использоваться для репарации дефектных оснований в ДНК.

13.10. Фаг Т7 содержит линейную двухцепочечную по всей длине молекулу ДНК. Частичное расщепление этой ДНК экзонуклеазой III с последующим отжигом выявляет наличие в ее структуре концевых повторов. При этом в отличие от фагов Т2 и Т4 у фага Т7 не происходит кольцевых перестановок генов. При инфекции фагом Т7 репликация фаговой ДНК инициируется на участке ori, расположенном на расстоянии, соответствующем 17% общей длины молекулы от левого конца ДНК. В репликации участвует линейная молекула ДНК; кольцевые формы не образуются. На более поздних, стадиях инфекции наблюдается образование весьма протяженных линейных конка-темеров ДНК Т7. Предложите модель репликации ДНК фага Т7, объясняющую необходимость возникновения конкате-мерных структур для полной репликации линейного фагового генома.

13.11. Используя в качестве матрицы ДНК, выделенную из любого организма, расщепленную на относительно небольшие фрагменты, содержащие одноцепо-чечные разрывы, с помощью ДНК-полимеразы I Е. coli можно получить представительный набор меченых последовательностей, соответствующих последовательностям исходной ДНК. Если единственным радиоактивным предшественником служит один из четырех нуклеотидов [ос-32Р] dYTP, то при последующей ферментативной деградации меченой ДНК будут образовываться 3'-32Р-дезок-сирибонуклеотиды, как показано на рис. 13.16. При наличии в реакционной смеси одного из четырех меченых предшественников (dNTP) и трех немеченых предшественников (dNTP) после синтеза и деградации по аналогичной схеме, располагая методом разделения и идентификации всех четырех 3'-32Р-дезоксирибонуРис. 13.16. Введение метки (32Р) при синтезе ДНК с помощью ДНК-полимеразы I и последующая деградация ДНК под действием микрококковой ДНКазы и диэстеразы из селезенки. Матричная цепь не показана. Заметьте, что радиоактивный фосфор, первоначально связанный с нуклеотидом Y, переносится при расщеплении на нуклеотид X.

клеотидов, можно для каждого из них определить количество связавшейся метки 32Р. С помощью такого подхода можно определить для нуклеотида частоту встречаемости соседних нуклеотидов. Поясните, как это сделать. Как, опираясь на полученные данные, показать, что в двух-цепочечной структуре ДНК комплементарные цепи скорее антипараллельны

5' 3' 5'—3' „

У 5,, чем параллельны 5, ^ ?

13.12. Штамм Е. coli lacZ~, несущий F'L ас + -фактор, мутагенизировали и высевали на лактозный ЕМВ-питательный агар при температуре 30°. (На этой среде колонии Lac+ имеют красную окраску, а Lac " бесцве

страница 27
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(17.09.2019)