Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

и клетки и поэтому сохранились в составе ДНК зрелых фаговых частиц.

Рис. 14.3. А. Фотография чашки Петри, на которой видна морфология негативных колоний (бляшек), образуемых фаговыми частицами kcl (прозрачные), Хс1+ (мутные) и гетерозиготами Хс1+ /с1 (крапчатые; показана стрелкой). (Courtesy Dr. Meselson, Harvard University.) Б. Распределение по плотности фагового потомства, образующегося при инфекции клеток на легкой среде целиком тяжелыми фагами с генотипами cl и cl+ при высокой множественности инфекции. В, Структура ДНК гетерозиготы Хс1+ /с1.

В

Генетический анализ рекомбинации

С помощью генетического анализа удалось идентифицировать ферменты, участвующие в процессе общей рекомбинации у Е. coli. При скрининге мутагенезированных клеток F " методом «отпечатков» можно на исходной чашке обнаружить колонии мутантных клеток, неспособных к образованию рекомбинантов при конъюгации с клетками Hfr на чашке-реплике. Оказалось, что мутации, влияющие на способность к рекомбинации, локализуются в трех генах, обозначенных гесА, гесВ и гесС. При изучении таких мутантов удалось идентифицировать функционирующие в нормальных клетках белки, кодируемые каждым из трех генов.

Белок RecA представляет собой удивительный полифункциональный фермент, вовлеченный как в общую рекомбинацию, так и в репарацию ДНК. Ген гесА + необходим для протекания всех процессов в системе

5' з'

3'

•5' •3'

Рис. 14.4. Белок RecA принимает участие в двух последовательных этапах переноса цепей при образовании структуры Холли-дея. Этап 1: перенос одной из цепей двухцепочечной ДНК к комплементарному участку другой молекулы ДНК, содержащему разрыв в гомологичной цепи. Этап 2: ре-ципрокный перенос цепи с образованием области перекреста, которая может перемещаться вдоль двухце-почечных участков ДНК обоих партнеров.

общей рекомбинации у Е. coli. Очищенный белок способен направлять все основные этапы образования структур Холлидея in vitro. Молекулы белка RecA связываются как с двухцепочечными, так и с одноцепо-чечными молекулами ДНК и, используя энергию гидролиза АТР, могут расплетать двойную спираль ДНК. Благодаря этому оказывается возможным взаимодействие комплементарных цепей различных молекул ДНК, участвующих в рекомбинации. Эта функция белка RecA обеспечивает осуществление процесса конъюгации (синапсиса) молекул ДНК с гомологичными нуклеотидными последовательностями (см. рис. 14.4, этап 1). Белок RecA катализирует также последующую переориентацию цепей с образованием крестообразной структуры Холлидея и дальнейшим перемещением области перекреста (рис. 14.4, этап 2).

Удобной моделью для изучения рекомбинации in vivo могут служить присутствующие в клетках Е. coli небольшие кольцевые молекулы плазмидных ДНК. При электронном микроскопировании очищенных препаратов ДНК плазмиды ColEl видно, что они содержат преимущественно кольцевые молекулы единичной длины, то есть мономеры. Однако удается обнаружить и некоторое количество молекул ДНК, имеющих форму восьмерки, в которой две мономерные плазмиды соединены в одной точке пересечения. Плазмида ColEl содержит один сайт узнавания для рестриктазы EcoRI. Расщепление «восьмерок» этой рестрикта-зой приводит к образованию двух изомерных форм, напоминающих структуры Холлидея (рис. 14.5). При этом, как видно из рис. 14.5, образуются по две пары плеч одинаковой длины, что указывает на то, что вышеупомянутые «восьмерки» действительно состоят из двух одинаковых плазмидных молекул, соединенных между собой крестообразной перемычкой. В плазмидных препаратах, полученных из штаммов Е. coli recA ~, «восьмерки» не образуются. Это означает, что они, по всей видимости, представляют собой промежуточные структуры, возникающие в ходе recA + -зависимой рекомбинации между плазмидами. В то же время эти промежуточные структуры присутствуют в препаратах ДНК из

штаммов E. coli recB ~ или recC ™. To есть можно предположить, что продукты этих двух генов участвуют в рекомбинационном акте после белка RecA. В действительности гены recB+ и recC+ кодируют две субъединицы АТР-зависимой нуклеазы. Эта нуклеаза, вероятно, выступает в роли фермента, специфически разрезающего (разрешающего) структуру Холлидея для завершения процесса рекомбинации.

Белок RecA играет также ключевую роль в репарации повреждений ДНК, вызванных воздействием ультрафиолетовых лучей или некоторых химических агентов на клетки Е. coli. Активация такой репарационной функции происходит при взаимодействии с одноцепочечными участками ДНК, образование которых непосредственно связано с повреждениями в молекуле ДНК. Белок RecA обладает протеолитической активностью, стимулируемой одноцепочечными ДНК. Эта протеолитическая активность проявляется в расщеплении по крайней мере двух типов белков

репрессоров. Один из них-это репрессор фага X, расщепление которого приводит к индукции профага. Другой гесЛ-чувствительный репрессор является продуктом гена lexA. Этот репрессор вовлечен в регуляцию уровня экспрессии гена recA и ряда других генов, отвечающих за репарацию ДНК и другие, так называемые 505-функции, способствующие выживанию клетки в экстремальных условиях. В норме репрессор lexA обеспечивает лишь невысокий уровень экспрессии гена recA, достаточный для обеспечения процессов общей рекомбинации. Однако при повреждении ДНК, угрожающем жизни клетки, стимулируется протео-литическая активность белка RecA и происходит расщепление репрессо-ра lexA. Это приводит к индукции генов uvr (они обсуждались в гл. 13) и других генов, связанных с репарацией ДНК и восстановлением нормальной жизнедеятельности клетки. Белок RecA в условиях его повышенной продукции, вероятно, непосредственно участвует в репарации, направляя рекомбинацию между поврежденными и неповрежденными участками дочерних молекул ДНК после репликации. Рассмотренные в этом разделе экспериментальные наблюдения позволяют сделать вывод о том, что образование структур Холлидея является промежуточным этапом в процессе рекомбинации у Е. coli. Формирование и разрешение структур этого типа находится под генетическим контролем. Модель Холлидея была изначально предложена им для интерпретации данных по рекомбинации при мейотическом делении, т. е. для эукариот. Применимость этой модели и для прокариот позволяет считать, что основные механизмы рекомбинации, характерные для прокариот и эукариот, очень схожи. Сейчас мы перейдем к рассмотрению доказательств реального существования структур Холлидея, а также данных, позволяющих представить процесс образования таких структур у эукариот.

Высокая отрицательная интерференция и генная конверсия

Анализ частот возникновения рекомбинантных генотипов при трехфак-торном скрещивании дает дополнительное (хотя и косвенное) подтверждение тому, что процесс рекомбинации сопровождается образованием гетеродуплексных участков ДНК. Впервые это было отмечено при изучении явления высокой отрицательной интерференции при скрещиваниях с участием очень тесно сцепленных генетических маркеров. Понятие «интерференция» (I), введенное нами в гл. 5, определяется формулой / = 1 — с, где с-коэффициент совпадения (коинциденции), т.е. отношение числа наблюдаемых двойных перекрестов к числу ожидаемых, при трех-факторном скрещивании. В большинстве случаев при скрещиваниях с участием маркеров в трех различных сцепленных генах (х — у — z) оказывается, что образование перекреста между х и у снижает вероятность образования второго перекреста в интервале между у и z. То есть в таких скрещиваниях величина с меньше 1, а / соответственно положительное число, отражающее наблюдаемую величину интерференции (см. гл. 5).

Рекомбинация очень тесно сцепленных маркеров как в прокариоти-ческих, так и в эукариотических организмах, как правило, характери

зуется значениями с, значительно большими 1. Это явление, характеризуемое отрицательными значениями величины /, называют высокой отрицательной интерференцией. Иначе говоря, вероятность двойного кроссинговера оказывается значительно выше ожидаемой. В этом можно убедиться на ряде примеров (приведенных в гл. 7 и 8), отражающих данные по генетическому картированию, которое проводилось для некоторых фагов и бактерий. Высокая отрицательная интерференция (иногда называемая также локализованной отрицательной интерференцией) наблюдается, например, в ряде трехфакторных скрещиваний между мутантами фага X. Значения с для каждого скрещивания представлены на графике (рис. 14.6) в форме зависимости от суммы частот рекомбинации в двух интервалах для каждой пары из трех использованных мутантов. При Rx + R2 < 0,01 наблюдаемое значение с для внешних маркеров превышает 70, что соответствует высоким отрицательным значениям /.

Четырех- или пятифакторное скрещивание позволяет наблюдать тройные и четверные перекресты. При этом также обнаруживается, Лчто тройные и четверные обмены имеют место чаще, чем можно было бы ожидать, полагая, что они происходят независимо друг от друга.

Достаточно наивная и, как стало ясно впоследствии, неверная интерпретация этих наблюдений сводилась к предположению, что на небольших участках ДНК двойные перекресты возникают чаще, чем можно ожидать на основании данных о частоте кроссинговера для каждой пары генетических маркеров. Сегодня мы понимаем, что явление высокой отрицательной интерференции в действительности связано не с возникновением множественных кроссинговеров на небольших участках хромосомы, как можно было бы полагать, исходя из определения интерференции. Напротив, в основе этого явления лежат процессы, затрагивающие область единичного перекреста. Механизмы, обусловливающие высокую отрицательную интерференцию, наблюдавшуюся при фаговом скрещивании, оставались неясными до тех пор, пока аналогичРис. 14.7. Нормальные и аберрантные аски, возникающие при скрещивании мутанта с серыми спорами и штамма дикого типа (черный цвет спор) гриба Sordaria fimicola. А. Изображены по группам обычные варианты расщепления: I. Проксимальный и ди-стальный варианты, образующиеся в результате расщепления при первом делении. II. Варианты чередующегося и симметричного распределения при расщеплении

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.12.2019)