Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

ждающееся рекомбинацией фланкирующих маркеров, но приводящее к закреплению гетеродуплексных участков в дочерних молекулах ДНК, проявляется подобно двойному кроссинговеру и характеризуется высокой отрицательной интерференцией даже в отсутствие репарации неправильных пар нуклеотидов (см. первую диаграмму на рис. 14.9, Б).

Данные, приведенные в таблице 14.1, отражают процессы гетероаллельной конверсии, наблюдаемые в асках, образуемых четырьмя различными диплоидными генотипами Saccharomyces cerevisiae, каждый из которых гетерозиготен по каким-либо двум из четырех гетероаллелей, отмеченных на генетической карте (рис. 14.8). Кроме того, каждый из диплоидов гетерозиготен по фланкирующим маркерам,

в частности petl и thrl, за рекомбинацией которых при мейозе можно вести наблюдение.

Например, диплоид BZ34 характеризуется наличием маркеров arg 4^4 и thrl на одной и petl и arg 4-17 на другой гомологичной хромосоме:

+ arg4-4 + thrl

petl + arg4-17 +

Для 690 асков, образуемых этим диплои-дом, наблюдалось восемь случаев конверсии org 4-4, семь из которых сопровождались рекомбинацией маркеров petl и org 4-17, фланкирующих arg 4-4. В приведенных данных не делается различий между конверсией от arg 4-4 к дикому типу и конверсией от дикого типа к arg 4-4, обнаруживаемых в асках с распределением аллелей 1:3 и 3:1. Кроме того, были зарегистрированы 42 случая конверсии arg 4-17, из которых 19 сопровождались рекомбинацией фланкирующих маркеров arg 4-4 и thrl. И наконец, в 5 случаях наблюдалась двойная конверсия arg 4-4 и arg 4-17, при этом в 3 случаях имела место рекомбинация фланкирующих маркеров petl и thrl. В таблице 14.1 аналогичным* образом представлены также результаты, полученные при изучении конверсии для трех других диплоидов.

На основании данных, приведенных в таблице 14.1, можно сделать три важных заключения. Во-первых, около половины (73/140) всех конверсионных событий связаны с рекомбинацией фланкирующих маркеров. Во-вторых, конверсия представляет собой замену одного исходного алле-ля на другой, участвующий в скрещивании. Так, аллель arg 4-4 дикого типа переходит при конверсии в мутантный аллель arg 4-4, а мутантный org 4-4 - в соответствующий аллель дикого типа. То есть конверсия не является случайным событием в том смысле, что не приводит к конверсии одного гетероаллеля в другой произвольный аллель. И в-третьих, сокон-версия двух гетероаллелей при скрещивании происходит чаще, чем этого можно было бы ожидать от двух независимых событий. Так, частота конверсии для arg 4-4 составляет 0,012 (8/690), а для arg 4-17-0,061 (42/690). Если бы два этих события были совершенно независимы, то частота совместной конверсии составляла бы 0,00073 (0,012 х 0,061). В то же время наблюдаемая частота совместной конверсии этих маркеров в действительности достигает 0,0072 (5/690). Этот и аналогичные ему расчеты, сделанные на основании данных таблицы 14.1 для других пар гетероаллелей агд4, приведены в таблице 14.2.

Образование структур Холлидея у эукариот

Согласно модели Холлидея, образование одноцепочечных разрывов и реципрокный обмен цепями (рис. 14.1, Б - Д) приводят к формированию симметричных гетеродуплексных участков ДНК у обоих партнеров, участвующих в обмене. В то же время анализ аберрантных асков, возникающих у некоторых видов грибов, указывает на то, что довольно часто гетеродуплексные участки ДНК при скрещивании образуются только у одного из партнеров.

В качестве примера рассмотрим трехфакторное скрещивание между двумя штаммами Ascobolus, при котором наблюдали за конверсией маркера т в асках, нерекомбинантных по фланкирующим маркерам а и Ъ. Модель Холлидея предсказывает образование с одинаковой частотой двух типов аберрантных асков 5:3 (рис. 14.10), возникающих за счет случайного выбора одной из двух цепей ДНК партнеров в качестве

Две гетеродуплексные Наблюдаемое Одна гетеродуплексная

хромата ды

Рис. 14.10. Аберрантные аски типа 5+ :3т и 3 + : 5т, образующиеся при скрещивании между штаммами Ascobolus, несущими различные аллели окраски спор ( + /т) и фланкирующих маркеров А/а и В/b. Показаны только аски, нерекомбинантные по фланкирующим маркерам. Для упрощения вместе сгруппированы аски типов 3 + : 5т и 5 + + : Зт, что позволяет подчеркнуть принципиальные различия между двумя возможными вариантами образования гетеродуплексных ДНК в ходе обмена (симметричный-слева и асимметричный-справа). Полагают, что распределение неправильных нуклеотидных пар, вовлеченных или невовле-ченных в процесс репарации, для хроматид и аллелей является случайным. (По Stadler D.R., Towe А. М., 1971. Genetics, 68, 401-413.)

Рис. 14.11. Модель Ме-зелсона-Рэддинга. Рекомбинация начинается с образования одноце-почечного разрыва в ДНК одной хроматиды, за которым следуют репарационный синтез и вытеснение соответствующей цепи (А).. Вытесняемая цепь внедряется в структуру двойной спирали партнера, образуя петлю (Б). Вытесняемая при этом цепь ДНК партнера подвергается деградации. Вслед за этим конец внедрившейся цепи соединяется ковалентно с концом, образовавшимся при деградации петли. В ДНК первого партнера продолжается репарационный синтез, приводящий к образованию асимметричного гетеродуплекса (В). Изомеризация приводит к образованию структуры Холлидея (Г), а перемещение области перекреста порождает симметричные участки гетеродуплекс-ной ДНК в обоих партнерах (Д). Разрешение структуры Холлидея при расщеплении в области перекреста может завершаться рекомбинацией фланкирующих маркеров (?) или сохранением типа сцепления, характерного для родительских молекул ДНК. (По Meselson M.S., Radding СМ., 1975. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 72, 358-361.)

мишени для репарации, а также за счет того, что некоторые неправильные пары нуклеотидов остаются нерепарированными. Только при выполнении последнего условия возможно возникновение асков с распределением 5:3. Экспериментальные данные, отраженные на рис. 14.10, указывают на значительную неравномерность в возникновении двух типов асков 5 :3. Эти и другие данные свидетельствуют о том, что во многих случаях рекомбинация не начинается с реципрокного обмена цепями.

Для интерпретации асимметричности в обмене цепями были предложены две различные модели. Каждая из них связана с образованием структуры Холлидея. Различия между ними обусловлены главным образом различиями в предполагаемых способах образования этих структур. Модель Мезелсона-Рэддинга (рис. 14.11) основана на предположении об образовании одноцепочечного разрыва в ДНК одного из партнеров. В месте разрыва инициируется репарационный синтез ДНК, при этом происходит вытеснение одной цепи, которая в итоге вступает во взаимодействие с комплементарной ей цепью ДНК другого партнера. Сопряженное протекание репарационного синтеза одной цепи в двойной спирали ДНК «донора» и деградация соответствующей цепи в ДНК «реципиента» приводят к возникновению структуры Холлидея, содержащей гетеродуплексный участок только в реципиентной ДНК. Модель Мезелсона-Рэддинга в сочетании с представлением о статистической репарации неправильных нуклеотидных пар может объяснить большинство результатов, полученных при изучении генной конверсии и анализе аберрантного расщепления у грибов.

Модель двухцепочечного разрыва-репарации (рис. 14.12) предполагает образование разрыва в обеих цепях с выступающими одноцепочечными концами в молекуле ДНК одного из партнеров. Оба выступающих конца внедряются в двойную спираль ДНК другого партнера. Репарационный синтез в обоих партнерах приводит к образованию асимметрических гетеродуплексных участков в реципиентной спирали. Разрыв в структуре донора закрывается, при этом содержавшаяся на его месте информация полностью замещается на ту, что содержится в соответствующей области ДНК реципиента. Образуются сразу две структуры Холлидея, разрешение которых может привести (как и в случае единичной структуры Холлидея) к возникновению конструкций, как рекомбинантных, так и нерекомбинантных по фланкирующим маркерам. Настоящая модель способна объяснить не только ряд уникальных наблюдений, сделанных при изучении рекомбинации у дрожжей, но также и те явления, которые с равным успехом интерпретируются в рамках модели Мезелсона - Рэддинга.

Развитие методов генной инженерии привело к разработке системы трансформации для дрожжей, что способствовало более глубокому изучению у них механизма рекомбинации. Гибридные плазмиды, содержащие участки дрожжевой ДНК с известными маркерами, клонированные на векторе Е. coli, могут быть введены в клетки дрожжей. При этом может происходить встраивание плазмидной ДНК в хозяйскую хромосому за счет рекомбинации между гомологичными последовательностями хромосомы и участка дрожжевой ДНК, входящего в состав плазмиды. При использовании плазмидной ДНК в замкнутой кольцевой форме удается с заметной частотой отобрать трансформированные дрожжевые клетки. В то же время введение двухцепочечного разрыва в дрожжевую

Рис. 14.12. Модель «двухцепочечный разрыв-репарация». Возникновение одноцепо-чечного разрыва в ДНК одной хроматиды инициирует деградацию этой цепи с образованием бреши (А). Дальнейшее действие нуклеаз приводит к образованию разрыва, а затем и бреши во второй цепи (Б). Рекомбинация начинается с внедрения одноцепочечных концов в двойную спираль ДНК партнера *(В). В ходе репарационного синтеза закрываются бреши и образуются два перекреста (Г). Правый перекрест разрешается за счет разрыва во внешней цепи (показано стрелкой). Оставшаяся структура Холлидея (слева) может быть разрешена при расщеплении в области перекреста, приводящем к рекомбинации фланкирующих маркеров (Д) или к восстановлению типов сцепления, характерных для исходных молекул ДНК (?). В обоих случаях с каждой стороны от репарированной бреши возникают асимметричные участки гетеродуплексной ДНК. (По Szostak J. W. et al, 1983. Cell, 33, 25-35.)

д

в

В

в

в

в

часть гибридной плазмиды с помощью рестрицирующей эндонуклеазы сопровождается 3000-кратным повышением частоты трансформации. Более того, если в дрожжевой участок плазмиды вводится делеция с помощью удал

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.10.2019)