Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

ения внутреннего рестрикционного фрагмента, то частота трансформации не снижается. Отобранные трансформанты содержат интегрированную плазмиду с внутренним фрагментом, последовательность которого оказывается полностью восстановленной на основе информации, заключенной в соответствующей области клеточной ДНК. Восстановление утраченного фрагмента происходит при участии гена

rad52, необходимого также для нормального протекания мейоза и репарации двухцепочечных разрывов, вызванных облучением. Таким образом, представляется весьма вероятным, что рекомбинация при мейозе действительно может начинаться с возникновения двухцепочечного разрыва.

Наконец, при изучении с помощью электронной микроскопии дрожжевой ДНК, выделенной из клеток на стадии мейотического деления, было обнаружено, что сочлененные молекулы ДНК соединены между собой не в одной точке, как это было показано на рис. 14.5 для плазмид Е. coli, а в двух, расположенных на расстоянии 100-1000 п.н. друг от друга. Если такие структуры действительно представляют собой интер-медиаты, возникающие в ходе рекомбинации, то это скорее подтверждает модель «двухцепочечный разрыв - репарация», чем модель Мезелсона-Рэддинга.

Сайт-специфическая и незаконная рекомбинация

Для рекомбинации между молекулами ДНК, которые характеризуются низким уровнем или даже полным отсутствием гомологии, используются механизмы, совершенно отличные от механизмов общей рекомбинации. С сайт-специфической рекомбинацией мы уже встречались на примере интеграции профагов (гл. 7), а с незаконной рекомбинацией-при знакомстве с подвижными генетическими элементами (гл. 8). У Е. coli протекание как сайт-специфической, так и незаконной рекомбинации не зависит от генов гесА, recB или recC. Различия между этими двумя типами рекомбинации выражены не очень четко и связаны со степенью сходства нуклеотидных последовательностей, участвующих в рекомбинации. В случае умеренных бактериофагов типа X участки attP и attB характеризуются очень высокой специфичностью в отношении связывания специализированных белков, направляющих рекомбинацию, которые кодируются фаговыми генами int и xis. Поэтому интеграция про-фага практически всегда происходит в участке attB, локализованном в хромосоме Е. coli между генами gal и Ыо. Однако при делеции сайта attB интеграция профага все же происходит с заметной, хотя и значительно более низкой частотой, в целый ряд других участков на хромосоме Е. coli. Подвижные генетические элементы характеризуются существенными различиями в уровне специфичности при выборе мишени для транспозиции.

Поскольку для этих типов рекомбинации степень сайт-специфичности варьирует в широких пределах, для классификации процессов рекомбинации, отличных от общей рекомбинации, можно опираться на более характерные признаки. Отличают рекомбинационные процессы, связанные или не связанные с репликацией ДНК. Так, интеграция профага-это консервативный процесс, в котором формирование рекомбинантных структур происходит при участии только заранее образовавшихся молекул ДНК. С другой стороны, считается, что для осуществления большинства транспозиционных событий требуется репликация ДНК.

Интеграция и эксцизия профага Я

Процессы интеграции и эксцизии профага X являют собой наиболее изученные примеры сайт-специфической рекомбинации. Интеграция направляется белком интегразой, продуктом фагового гена int, при участии клеточного белка, роль которого в этом процессе до конца не изучена (см. рис. 7.8). При рекомбинации между фаговым attP-сайтом POP' и хозяйским хромосомным а«В-сайтом ВОВ' образуются два реком-бинантных сайта ВОР' и РОВ' слева и справа от встроенной ДНК профага. Индуцируемая эксцизия (вырезание) профага осуществляется посредством рекомбинации между сайтами РОВ' и ВОР' с восстановлением исходных сайтов POP' и ВОВ'. Процесс эксцизии не является простым обращением интегративной рекомбинации. Он затрагивает иные ДНК-субстраты и протекает при участии как интегразы, так и другого фагового белка (эксцизионазы), продукта гена xis.

В фаговом геноме сайт POP' и гены int и xis примыкают друг к другу, образуя своего рода обособленную функциональную единицу, ответственную за сайт-специфическую рекомбинацию. Транскрипция генов int и xis находится под контролем двух различных промоторов. Один из них расположен вне вышеупомянутой структурно-функциональной единицы, что обеспечивает согласование инициации рекомбинационных процессов с определенными этапами в жизненном цикле фага. На начальной стадии инфекции фагом % транскрипция гена int активируется регуляторным белком ell. При его участии РНК-полимераза может считывать int с промотора рг, локализованного внутри гена xis. Благодаря этому экспрессируется только ген int и образуется интеграза, обеспечивающая встраивание инфицирующего фага в сайт ВОВ' на хромосоме клетки-хозяина (рис. 14.13). С другой стороны, когда в лизогенной

клетке происходит индукция профага, транскрипция генов int и xis происходит с общего промотора pL. Нарабатываются белки, продукты генов int и xis, которые направляют рекомбинационную эксцизию профага из хозяйской хромосомы. (Вся совокупность этих и других явлений, составляющих основу жизненного цикла фага X, будет специально разобрана в гл. 15.)

Пониманию деталей молекулярного механизма шГ-зависимой рекомбинации способствовало изучение этого процесса in vitro, а также установление первичной структуры участков POP' и ВОВ' и рекомбинантных участков ВОР' и РОВ'. Все эти участки характеризуются наличием общего центрального фрагмента (кора, от англ. core-сердцевина) протяженностью 15 п. н., на котором и разыгрываются основные рекомбинационные события (рис. 14.14).

Каждое из плеч (Р, Р', В и В') характеризуется особой, отличной от других плеч нуклеотидной последовательностью. Функциональное значение этих участков последовательности исследовали в рекомбинацион-ной системе in vitro, содержащей очищенную интегразу и необходимые клеточные белки. В этой системе можно наблюдать рекомбинацию участков POP' и ВОВ', встроенных в сверхскрученную ДНК плазмиды pBR322, с помощью методов, обсуждавшихся в гл. 9. С использованием клонированных фрагментов, содержащих делеции разной величины в том или ином из плеч Р, Р', В и В', удается определить необходимый для рекомбинации минимальный размер функциональных участков, окружающих общую кор-последовательность. Было установлено, что функциональный участок POP' содержит по 240 п. н. с каждой стороны от кора. В то же время функционально необходимый участок ВОВ' по размеру не намного превышает саму 15-нуклеотидную кор-последовательность. Участки нуклеотидной последовательности, с которыми специфически связывается интеграза фага X, были идентифицированы с помощью так называемого «футпринтинга» (от англ. footprint - след ноги: см. Дополнение 14.2). В связывании участвуют центральная область POP' протяженностью 34 п. н., включающая кор, а также два участка последовательности в плече Р и один, более протяженный, в плече Р'. С другой стороны, единственный участок узнавания на хромосоме представляет собой последовательность из 20 п. н., включающую область кора ВОВ'. Вследствие различий в структуре плечевых участков фагового и хозяйского afr-сайтов рекомбинантные сайты РОВ' и ВОР' в функциональном отношении отличаются от POP' и ВОВ'. Это отличие несомненно и проявляется в том, что интеграза, направляющая процесс встраивания профага, сама по себе оказывается неспособной катализировать обратную реакцию, для осуществления которой необходимо участие дополнительного белка - продукта гена xis.

Механизмы встраивания и вырезания профага пока в точности не известны. Установлено, что очищенная интеграза обладает топоизоме-разной активностью. Она делает одноцепочечный разрыв в суперскру-ченной ДНК, благодаря чему осуществляются свободное вращение и удаление супервитков. Вслед за этим интеграза направляет замыкание фосфодиэфирной связи без использования каких-либо дополнительны? источников энергии. Считают, что энергия первоначально расщепленное связи сохраняется благодаря ковалентному связыванию высвободившейся 5'-фосфатной группы с самой интегразой. Известно, что при рекомбинации между POP' и ВОВ' образуется очень короткий участок геBOB'

GCCTGC TT TT TTATACTAACTTG CGGACGAAAAAATATGATTGAAC

WMW\MMMMMҐA

BOP'

GCCTGC TTTTTTATACTAAGTTG CGGACCAAAAAATATGATTCAAC

TTCAGCTTTTTTATACTAACTTG AAGTCGAAAAAATATGATTGAAC

РОВ'

Рис. 14.14. Нуклеотидные последовательности внутри и вокруг общего 15-нуклеотидного кора (выделены жирным шрифтом) участков POP' и ВОВ', а также рекомбинантных участков ВОР' и РОВ'. Отмечены гетеродуплексные области ДНК на участках ВОР' и РОВ', образующиеся в результате mt-зависимой рекомбинации. (По Mizuuchi К. et al., 1981. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 45, 429-437.)

теродуплексной ДНК, а два одноцепочечных разрыва возникают в разных точках внутри общей кор-последовательности. Как показано на рис. 14.14, расстояние между точками разрыва составляет 7 п.н. На основании данных электронной микроскопии можно предположить, что мономерные молекулы интегразы при взаимодействии с ДНК олигоме-ризуются, что способствует образованию контактов между участками POP' и ВОВ'. Разрезание и воссоединение цепей, приводящее к рекомбинации, может протекать с образованием промежуточной формы, подобной структуре Холлидея с очень коротким гетеродуплексным участком. При шг-зависимой рекомбинации в редких случаях удается наблюдать образование гетеродуплексных участков, заметно выходящих за пределы области POP'. Таким образом, возникновение промежуточной крестообразной структуры характерно как для сайт-специфической, так и для общей рекомбинации.

Как уже упоминалось, для осуществления сайт-специфической рекомбинации фага X необходимо присутствие некоторых хозяйских белков. Штаммы Е. coli, мутантные по одному из генов ЫтА, ЫтВ или hip, неспособны обеспечивать интеграцию профага X. Мутации в этих генах носят плейотропный характер и блокируют также интеграцию других типов профагов на других соответствующих участках ДНК. Более того, эти мутации

страница 32
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)