Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

препятствуют развитию в клетках транспозоноподобного фага Ми, а также точному вырезанию транспозонов, определяющих устойчивость к антибиотикам (см. следующий раздел). Плейотропность этих мутаций, сказывающихся как на сайт-специфической, так и на незаконной рекомбинации, свидетельствует о том, что соответствующие клеточные белки играют скорее некоторую неспецифическую роль, например способствуют реализации взаимодействий ДНК-ДНК или ДНК-белок.

Дополнение 14.2. Футпринтинг-метод изучения

ДНК-белковых взаимодействий

Взаимодействие белков с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК играет важнейшую роль в функционировании генетического материала. Для изучения взаимодействий между белками и участками нуклеотидной последовательности удается использовать те же экспериментальные подходы, что и для определения нуклеотидной последовательности.

В гл. 9 мы рассмотрели, как при элек-трофоретическом анализе одной из цепей рестрикционного фрагмента ДНК, содержащей радиоактивную метку на одном конце и случайно расщепленной тем или иным способом, удается выявить полный набор фрагментов, отличающихся последовательным изменением длины с шагом в один нуклеотид. В примере, приведенном на рис. 9.8, случайное расщепление в каждом случае происходит по одному из четырех нуклеотидов. Все возможные фрагменты таким образом распределяются по четырем дорожкам, в каждой из которых разделяются фрагменты, заканчивающиеся на А, Т, G или С. При этом нуклеотидную последовательность искомого фрагмента ДНК можно считывать непосредственно по радиоавтографу, полученному с геля после электрофореза.

Рис. 14.15. Локализация сайтов связывания интегразы фага X с участком POP' с помощью метода «фут-принтинга». Аликвоты, содержащие рестрик-ционный фрагмент, 5'-конец одной из цепей которого помечен 32Р, подвергали частичному расщеплению неокарциностатином (расщепляет по А и Т) в присутствии и в отсутствие интегразы или гепарина. Набор образующихся фрагментов анализировали с помощью гель-электрофореза (три левые дорожки). В двух правых дорожках — фрагменты, образующиеся при расщеплении того же меченого фрагмента по пури-новым или по пирими-диновым нуклеотидам методом Максама — Гилберта, для идентификации участков последовательности, защищаемых интегра-зой. (По Hsu P. L, Ross W., Landy А., 1980. Nature, 285, 85-91.) Reprinted by permission. Copyright © 1980-Macmillan Journals Limited.

В том случае, когда нуклеотидная последовательность уже известна, можно установить, какие участки последовательности связываются с определенным белком. Для этого достаточно определить участки, защищаемые этим белком от расщепления. Защищенные участки идентифицируются на основании данных электрофореза, по исчезновению полос, соответствующих продуктам статистического расщепления, концевые нуклеотиды которых попадают в область связывания с белком. Именно этот подход был использован для локализации сайтов связывания интегразы с участком POP' ДНК фага X.

Рестрикционный фрагмент, содержащий участок POP' и меченый 32Р по одному из 5'-концов, случайно расщепляли ДНКазой I (или любым другим способом, приводящим к образованию одноцепочечных разрывов) в присутствии и в отсутствие интегразы. После этого оба образца нагревали для расхождения цепей, только одна из которых содержала метку, и анализировали с помощью электрофореза. Результаты такого эксперимента представлены на рис. 14.15. При электрофорезе образца, расщепленного в отсутствие ин-тегразы, наблюдается полный набор фрагментов расщепления. В случае образца, полученного в присутствии интегразы, выявляются характерные пропуски (или «следы» -footprints), соответствующие участкам последовательности, защищенным от расщепления, благодаря связыванию с интегразой. Сравнивая положения t пропусков с расположением фрагментов, образующихся при использовании специфических методов расщепления (также показано на рис. 14.15), удается точно идентифицировать защищенные ну-клеотиды в известной последовательности области POP'. Как показано на рисунке, интеграза защищает общую кор-после-довательность (рис. 14.14), а также один участок в плече Р' и два участка в плече Р. В эксперименте, отраженном на рис. 14.15, для изучения относительной прочности связывания интегразы с различными участками POP' используется конкурентное связывание с ДНК полианиона гепарина. Можно видеть, что гепарин вытесняет интегразу из всех участков связывания, за исключением сайта, расположенного в плече Р'. Вероятно, с этим сайтом интеграза связывается значительно прочнее, чем с другими сайтами узнавания белка в области POP'.

Подвижные генетические элементы

В гл. 8 мы рассмотрели основные особенности внедряющихся последовательностей (или IS-элементов) и транспозонов. Подвижные элементы представляют собой автономные единицы, в нуклеотидной последовательности которых заключена информация о структуре специализированных белков, обеспечивающих их перемещение. Такое перемещение (или транспозиция) достигается за счет специфического взаимодействия соответствующего белка с концевыми последовательностями перемещающегося элемента. Процесс транспозиции можно разделить на два этапа. На первом-нуклеотидная последовательность концевых участков подвижного элемента соединяется с ДНК-мишенью, специфически расщепленной на участке встраивания. На втором этапе происходит репликация подвижного элемента, не сопровождающаяся репликацией ДНК, в которую происходит встраивание. Таким образом, одна копия подвижного элемента оказывается включенной в ДНК-мишень, а другая сохраняет свою прежнюю локализацию. При этом обычно происходит дупликация небольших участков последовательности ДНК-мишени (по 5-9 п.н.), примыкающих к каждому из концов встроившегося элемента. Для подвижных элементов различного типа порядок реализации этих этапов может быть различным. Был предложен целый ряд возможных механизмов транспозиции. Следует отметить, что в рамках такого механизма удовлетворительное объяснение должны найти самые разнообразные явления, так или иначе связанные с транспозицией (рис. 14.16).

На сегодняшний день наиболее полно изучены подвижные элементы ТпЗ и родственный ему уЬ. Транспозон ТпЗ имеет размер 4957 п.н. и содержит ген, кодирующий фермент р-лактамазу (В1а, рис. 14.17), определяющий устойчивость к ампициллину. На обоих концах ТпЗ находятся инвертированные повторы протяженностью 38 п. н. При анализе мутантов ТпВ было установлено, что для проявления транспозиционной активности последовательности обоих повторов должны оставаться неповрежденными. Мутационные изменения в этих последовательностях не

Межмолекулярные процессы: Транспозиция

Коинтеграция — слияние репликонов

Внутримолекулярные процессы:

Точное вырезание

XY

А В СОЕ

X Y

D Е

Двойная инверсия

СБА

Делегирование

X Y , , АВ СОЕ

Встраивание по соседству

X Y

А В С О Е

или

X Y

X Y

ЕЕ}

А ВС

ЛВС

DE

DE

Смешанные процессы:

ABC

Кооперативная транспозиция>

или

или

—>

DEF

ABC

DEF

Рис. 14.16. Виды хромосомных перестроек, связанных с перемещением внедряющихся IS-эле-ментов и транспозонов. Считается, что процесс точного вырезания не связан непосредственно с транспозицией, однако для полноты картины он включен в общий список.

удается скомпенсировать с помощью комплементации, что свидетельствует о непосредственном участии концевых повторов в механизме транспозиции. ТпЗ несет еще две функции, потеря которых может быть скомпенсирована за счет комплементации, что позволяет отнести эти функции к действию определенных белков, кодируемых ТпЗ. Один из этих белков, продукт гена tnpA, необходим для осуществления всех транспозиционных процессов. Другой, кодируемый геном tnpR, дей38

1000

2000

I

3000

4000

38

tnpA

Рис. 14.17. Генетическая организация транспозона ТпЗ. На концах помечены инвертированные повторы протяженностью по 38 п.н. ТпЗ кодирует три белка; показано направление транскрипции соответствующих генов. Белок, продукт гена tnpR, связывается с областью IRS

IRS

(400 п. н.), что сопровождается репрес сией транскрипции генов tnpA и tnpR, а также может участвовать в сайт-специфической рекомбинации между двумя областями IRS. Нумерация-в нуклеотидных парах, начиная с левого конца транспозона.

ствует как репрессор гена tnpA и своего собственного гена и играет со ответственно важную роль в регуляции транспозиции. Регуляторна роль белка tnpR подтверждается тем, что мутации в соответствующее гене приводят к повышению частоты транспозиции (приблизительш в 1000 раз) благодаря дерепрессии гена tnpA. Ферментативная функци белка tnpR заключается в разрешении промежуточных структур, возни кающих в ходе транспозиции. Возникновение коинтегратов является не обходимым промежуточным этапом во всех транспозиционных процес сах, характерных для ТпЗ и уб (см. рис. 14.16). Продукт гена tnpR, ит резолваза (от англ. to resofoe-разрешать), как у ТпЗ, так и у уб направ ляет сайт-специфическую рекомбинацию между двумя копиями транс позона по «внутреннему центру разрешения» (IRS-internal resolutio site), расположенному между генами tnpA и tnpR (рис. 14.17). В облает IRS содержатся также сайты связывания резолвазы, как репрессор* подавляющего транскрипцию генов tnpA и tnpR.

Перемещающийся элемент уб по структурно-функциональной орга низации очень схож с ТпЗ и несет точно такой же ген tnpR, что указы вает на близкое родство этих элементов.

Предполагаемый механизм транспозиции ТпЗ, учитывающий рол промежуточного коинтеграта, представлен на рис. 14.18. Предполагав! ся, что одноцепочечные разрывы возникают в комплементарных цепя ДНК на обоих концах транспозона. В комплементарных цепях ДНК мишени также образуются разрывы, отделенные друг от друга опреде ленным числом нуклеотидных пар, которые по окончании транспозици окажутся дуплицированными и расположенными по обе стороны о встроившегося транспозона (см. табл. 8.1 и 8.2). В области разрыво концы транспозона соединяются с выступающими концами разрыв ДНК-мишени. При этом образуются две «вилки» со свободными З'-ОН группами, которые мог

страница 33
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.10.2019)