Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

перемещающихся внутри клетки продуктов.

Дополнительные свидетельства в пользу оперонной теории были получены благодаря открытию «полярных» мутаций. Было обнаружено, что nonsense (атЬег)~мутации в гене Z, приводящие, естественно, к утрате р-галактозидазной активности, часто проявляются и в исчезновении пермеазной и трансацетилазной активности в клетках с генотипом У + А +. Nonsense-мутации в гене У, лишающие клетку пермеазной активности, тоже часто приводят к подавлению трансацетилазной активности в клетках с генотипом А + . И в то же время эти мутации никак не

гающего к оператору 0е промотора. Б, В гетерозиготном частичном диплоиде (0 + /0е) ген 0е проявляется как доминантный. В отсутствие индуктора транскрипция происходит на хромосоме, содержащей 0е, но не на хромосоме, содержащей О +. Фенотипическим проявлением как гаплоидных, так и частично диплоидных клеток, несущих мутантный ген 0е, является конститутивный синтез фермента.

сказываются на В-галактозидазной активности. Такой полярный эффект nonsense-мутаций, согласно представлениям Жакоба и Моно, указывает на то, что транскрипция и трансляция полицистронной мРНК происходят в направлении Z-Y-A, а единственный промоторный участок находится слева от гена Z. Полярное влияние nonsense-мутаций часто наблюдается для оперонов, транскрибируемых с образованием полици-стронных мРНК. Механизм реализации полярного влияния nonsense-мутаций в одном гене на экспрессию примыкающих к нему генов дикого типа будет рассмотрен нами несколько позже.

На сегодняшний день оперонная теория получила весьма детальное экспериментальное подтверждение. Удалось выделить репрессор в чистом виде и показать, таким образом, что он действительно имеет белковую природу. Была определена аминокислотная последовательность белка-репрессора, которая, как оказалось, полностью совпадает с последовательностью, предсказанной на основании определения нуклеотидной последовательности гена J. Была также установлена нуклеотидная последовательность регуляторных участков /ас-оперона, промоторного и операторного (рис. 15.9), локализованы мутации в этих участках. Показано, что очищенный репрессор в отсутствие индуктора действительно связывается с изолированным операторным фрагментом ДНК. Репрессор также связывается с индуктором, при этом происходит аллостерическое изменение его пространственной структуры, приводящее к значительному ослаблению связи репрессора с операторной областью ДНК.

На примере /ас-репрессора, как на модели, было изучено такое важное^ явление, как специфическое связывание регуляторного белка с регу-ляторной областью ДНК. Этот феномен лежит в основе практически всех систем контроля экспрессии генов. Из всей ДНК Е. coli, состоящей из 3,2106 п. н., /ас-репрессор узнает и прочно связывается только с одной операторной последовательностью, имеющей длину лишь 24 п. н. (рис. 15.10). Операторная последовательность включает симметричный палиндромный участок протяженностью 16 п. н. Палинд-ромными называют последовательности, которые по каждой из цепей (с соблюдением полярности) считываются одинаково как слева направо, так и справа налево.

Активный /ас-репрессор представляет собой тетрамер, построенный из четырех идентичных полипептидных цепей, кодируемых геном loci. Каждая цепь содержит 360 аминокислотных остатков. Реализация двух аспектов функционирования репрессора-связывание с ДНК и связывание с индуктором-определяется двумя различными участками структуры цепи. В связывании тетрамерного репрессора с ДНК основную роль играет N-концевая последовательность, содержащая около 50 аминокислотных остатков.

Каждая из двух частей операторного палиндрома связывается с одной из четырех субъединиц тетрамерного репрессора. Взаимодействие с репрессором является кооперативным-связывание одной субъединицы усиливает связывание другой. Расположение обеих пар, образуемых четырьмя субъединицами репрессора, характеризуется симметрией второго порядка. Таким образом, каждая пара может кооперативно связываться с палиндромным участком (рис. 15.10).

Генетические свидетельства в пользу кооперативного характера связывания репрессора были получены при изучении некоторых мутаХромосома

E.coii

Ген/

САР-сайт

Промотор

Оператор

Защищается репрессором

Ген/

1 -м

5' GGAAACCGGGCACTGAGCGCAACGCAATTAATCTGAGTTAGCTCACTCATTACCCACCCCAGGCTTTACACTTTATCCTTCCCCCTCGTATCTTGTCTCGAATTCTCACCGGATAACAATTTCACACAGCAAACAGCTATGACCATC3' УCCTTTCGCCCGTCACTCGCGTTGCGTrAATTACACTCAA"TCGAGTGACTAATCCGTGGGGTCCGAAATCTGAAATACGAAGGCCGAGCATACAACACACCTTAACACTCGCCTATTCTTAAAGTGTGTCCTTTGTCGATACTGGTAC5J

г

Последовательность ДНК

Делеции

V*5

XS554

XS55J

Рис. 15.9. Нуклеотидная последовательность регуляторной области /аооперона Е. coli. По известной аминокислотной последовательности репрессора и р-галактозидазы можно идентифицировать кодирующие участки генов / и Z. Идентификация операторного и промоторного участков основана на локализации последовательностей, которые защищаются от ферментативной деградации при связывании с репрессором и РНК-полимеразой соответственно. Делеции или точечные мутации, изменяющие ту или иную функцию, локализуются в определенных участках последовательности, что позволяет провести дальнейшее соотнесение структуры и функций. Точечные замены в положениях — 57 и - 66 в области САР-сайта проявляются в фенотипе lac ~, вероятно препятствуя кооперативному связыванию пары димеров САР-белка с соответствующей симметричной последовательностью (подчеркнута с обеих сторон). (По Reznikoff W. S., Abelson I.N., 1978. In The Operon, ed. by J.H. Miller, W. S. Reznikoff, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N. Y. и O'Neill M.C. et al., 1981. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 2213.)

ций 1~, обозначаемых Конститутивные мутации 1~° подавляют

способность репрессора связываться с операторной ДНК. В частичных дишюидах они ведут себя как доминантные-генотипу i~Dji+ соответствует конститутивный фенотип. Доминантность этих мутаций реализуется за счет образования смешанных тетрамеров. Смешанная пара, состоящая из мутантной и нормальной субъединицы, утрачивает способность к кооперативному связыванию с ДНК и соответственно к подавлению транскрипции.

Все мутации / + картируются на участке гена I, кодирующем N-KOH-цевую область полипептида, т.е. ту область, которая непосредственно связывается с ДНК. С другой стороны, репрессор, продуцируемый му-тантными клетками / ~, способен нормально связываться с индуктором. Это означает, что участок связывания с индуктором локализуется вне N-концевой области репрессора. Такое представление подтверждается при рассмотрении мутаций I другого типа Is, которые проявляются в фенотипе суперрепрессии. В клетках Is репрессор связывается с оператором независимо от присутствия индуктора. Все мутации этого типа картируются в гене / вне области, кодирующей 50 N-концевых аминокислотных остатков репрессора. Таким образом, можно полагать, что /аорепрессор содержит два функционально различных домена.

Представления о доменной организации молекулы репрессора были подтверждены с помощью биохимических методов. При обработке очищенного нативного репрессора протеолитическим ферментом трипсином N-концевые полипептиды отщепляются от тетрамерного «кора». Оставшийся после этого кор-белок может связывать индуктор, но не способен связываться с ДНК. Таким образом, N-концевые участки полипептидных цепей (протяженностью около 50 аминокислотных остатков), вероятно, выступают за пределы относительно компактного тетрамерного кора и могут «внедряться» в бороздки двойной спирали ДНК, узнавать и прочно связываться с операторной последовательностью. Как мы убедимся в дальнейшем, такой способ структурно-функциональной организации характерен для многих белков, специфически узнающих определенные последовательности ДНК.

Взаимодействие очищенного fac-penpeccopa с ДНК подробно изучено in vitro. Для оценки прочности связывания белка как с операторной, так и с любой другой ДНК можно пользоваться значением кон

станты диссоциации, определяемой по закону действующих масс как

К =

[О] [R] [OR]

где [О], [R], [OR]-это молярные концентрации операторной ДНК, репрессора и комплекса оператор—репрессор соответственно. Для опера-тор-репрессорного комплекса значение К составляет величину порядка Ю-13 М, что свидетельствует о высокой прочности этого комплекса. Исходя из этих данных становится ясно, почему присутствие всего лишь десяти молекул репрессора в клетке оказывается достаточным для полной репрессии /ас-оперона.

Репрессор обладает также достаточно высоким сродством и к неоператорной ДНК. Так, с poly-d(AT) он связывается с константой диссоциации около 10"8 М. На прочности связывания с неоператорной ДНК присутствие индуктора никак не сказывается. Эти данные указывают на то, что в клетке новосинтезированные молекулы репрессора, а также комплексы репрессор-индуктор всегда связаны с ДНК. Тетрамеры репрессора, судя по всему, отыскивают операторную последовательность скорее с помощью линейной диффузии, или «скольжения», по хромосоме, чем посредством обычной пространственной диффузии в цитозоле. Ясно, что первый способ поиска должен быть намного оперативнее второго (рис. 15.11). Именно потребности быстрого поиска, по-видимому, объясняют особую выгоду палиндромного строения операторной последовательности, которая в этом случае может быть идентифицирована репрессором при продвижении по хромосоме с любой стороны. Модель поиска оператора /дс-репрессором, основанная на представлении

РепрессорРис. 15.11. Схематическое изображение процесса поиска /сс-ре-прессором области lac-оператора на хромосоме Е. coli, организованной в тесно сплетенный

клубок-нуклеоид. Подробности-в тексте.

о скольжении по хромосоме, помогает понять также выгоду тетрамер-ной структуры, которая характерна для репрессора, несмотря на то, что собственно с ДНК связываются только две из четырех субъединиц белка. Как известно, хромосома E.coli, имеющая колоссальный линейный размер, в действительности плотно сплетена в очень компактный клубок -нуклеоид. Кроме того, с ДНК

страница 37
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)