в результате чего репрессор начинает прочно связываться с оператором. С другой стороны, при недостатке триптофана происходит его диссоциация из комплекса с репрессором, после чего и сам репрессор отделяется от операторной последовательности; начинается транскрипция ггр-оперона. В этом случае говорят, что триптофан выступает в роли корепрессора trp-оперона.

Примерный размер

в нуклеотидах

Структурные гены

Ре гуля торные элементы

Полици стройная мРНК

Аттенуированная лидерная РНК

Полнпептиды

Ферментнь1е комплексы

Катализируемые реакции

Vlll. I т

у,

4- ^

Антранилатсинтаза комп. I Антранилатсинтаза Фосфорибозил- Триптофан/ комп. I [ антранилат-изомераза синтаза Q

+ Глутамин

Комп. I, Комп.П2

\У Фосфорибозил -/пи рофосфат

/фосфорибозилантра- Индол 3-глицеро нилаттрансфераза фосфат-синтаза

Триптофан-синтаза а

Рис. 15.20. Триптофановый оперон (trp) Е. coli. Показаны два продукта транскрипции-полицистронная мРНК и аттенуированная РНК, считываемая с лидерного участка в условиях терминации транскрипции. (По Piatt Т., 1978. In: The Operon, eds. I.H. Miller, W. S. Reznikoff, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)

При изменении концентрации триптофана от предельно высокой до предельно низкой наблюдается примерно 600-кратное увеличение уровня экспрессии frp-оперона. В то же время сам комплекс (репрессор — триптофан) отвечает только за 70-кратное увеличение уровня транскрипции оперона. Более того, мутации, инактивирующие репрессор, не снимают полностью влияние триптофана на экспрессию trp-оперона. В отсутствие репрессора наблюдается 8-10-кратное различие в уровне транскрипции генов оперона в зависимости от содержания в среде триптофана. Эта разновидность контроля экспрессии называется аттенуа-цией. Она связана с регуляцией на участке, расположенном между промотором и первым геном триптофанового оперона trpE. Этот участок, называемый аттенуатором (а), был открыт, когда впервые выяснилось, что наличие небольших делеций справа от промотора trp повышает уровень экспрессии генов оперона не менее чем в восемь раз. Поскольку эти делеций не затрагивают ни операторной, ни промоторной области, можно было предположить, что аттенуатор по сути дела является терминатором. Анализ РНК-транскриптов, инициированных на промоторе trp в нормальных клетках E.coli, действительно показал, что большинство из них терминированы в области лидерной последовательности (рис. 15.20) в точке, отстоящей на 140 п. н. от промотора. При этом лишь в 10% случаев поток транскрипции достигает структурных генов оперона. Нуклеотидная последовательность лидерного транскрипта trp-оперона, терминируемого на аттенуаторном участке, показана на рис. 15.21. Она характеризуется двумя любопытными особенностями. Первая-это наличие сайта связывания с рибосомой. За этим сайтом следует открытая рамка считывания, кодирующая небольшой полипепG U A A

С A

G G —100

U С

A A

90-C A

С U

А С

C U G A

U—A A —U U-»A-110 G—C и С

80-G..-C If0

A A — UUUUUUUU-OH C-G—С G—С—G

Участок связывания с рибосомой G • • • С • • • G

j G — C—G—130

1 10 20 30 40 50 60 70 С— G--C

PPP-AAGUUCACGUAAAAAGGGUAUCGACAAUGAAAGCAAUUUUCGUACUGAAAGGUUGGUGGCGCACUUCCUGAA л7{/c'"r A

4JL-HL^J^J1-TJL-H4Jl-HLr-l4r-J4J4JLrJ4J4rJ ., Gu

Met Lys Ala He Phe Val Leu Lys Gly Trp Trp Arg Thr Ser Stop A A

Рис. 15.21. Нуклеотидная последовательность аттенуаторного лидерного транскрипта trp-one-рона Е. coli. Отмечен участок связывания с рибосомой и участок, кодирующий 14-членный полипептид, содержащий два соседних остатка триптофана. Терминация происходит после считывания полиуридинового сегмента, следующего за участком, образующим шпилечную структуру (3 :4). Показана также альтернативная вторичная структура, включающая петлю гораздо большего размера (2:3). (По Lee F., Yanofsky С, 1977. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 4365.)

сит выбор альтернативного варианта вторичной структуры транскрипта. Терминация происходит при образовании шпилечной структуры 3 :4. (По OxenderD.L et al, 1979. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 5524.)

тид из 14 аминокислот, в числе которых-два соседних остатка триптофана. Само по себе это достаточно примечательно, поскольку частота встречаемости триптофана в белках обычно составляет 1 на 100 аминокислотных остатков. Вторая особенность заключается в присутствии последовательностей, которые могут формировать три взаимоисключающих варианта вторичной структуры, показанные на рис. 15.21 и 15.22. Одна из шпилечных структур очень напоминает структуру терминатора. Обе эти особенности были обнаружены также в структуре других оперонов биосинтеза аминокислот при анализе последовательности соответствующих лидерных транскриптов. Каждый из этих транскриптов кодирует небольшой полипептид, содержащий несколько аминокислотных остатков - продуктов биосинтеза, направляемого данным оперо-ном (рис. 15.23). Последовательность каждого из них может формировать три взаимоисключающих варианта вторичной структуры, один из которых напоминает структуру терминатора. Эти наблюдения привели к формулировке модели аттенуации, основанной на представлении о том, что рибосома, транслирующая лидерный полипептид, оказывает влияние на выбор варианта вторичной структуры транскрипта и таким образом определяет, произойдет ли остановка транскрипции после того, как будет синтезирована терминаторная петля, или транскрипция будет продолжена на протяжении всего остального оперона. Эта модель была проверена экспериментально и на сегодняшний день считается в основном верной.

Согласно этой модели, имеет место тесное сопряжение процессов транскрипции и трансляции, за счет чего поведение РНК-полимеразы определяется влиянием первой рибосомы, которая связывается с синтезируемым РНК-транскриптом. Взаимодействие осуществляется благодаря формированию особой вторичной структуры на участке транскрипта, расположенном между рибосомой и РНК-полимеразой. Как уже упоминалось, лидерный транскрипт может образовать три варианта вторичной структуры -1 :2, 2:3 и 3:4 (терминатор). В лидерном trp-транскрипте находятся два триптофановых кодона, расположенных таким образом, что если рибосома ввиду недостатка в среде триптофанил-т РНКТгР задерживается рядом с ними, то оказывается, что она тем самым препятствует образованию первой петли 1 :2

his: Met~ThT-Ara-Val-Gln~Phe-L\s-HIS-HIS-Hl$-Hl$-HlS-HlS-HlS-Pro-Asp

ркеЛ: Met-Lvs-His-lle-Pro-PHЈ-PHЈ-PHЈ-Ala-PHE-PtiE-PriE-Thr-PHЈ-Pro

thr: Met—Lv$—At%—ILE—Ser—THR—THR—1LE—THR—THR—THR—ILE—THR—ILE-THR —Т HR-Gly—Asn—Gly—Ala—Gly

ieu: Met-Ser-His-lle-Val-Afg-Phe-Thr-Glv-LEU-LEU-LEU-LEU-Asn-Ala-Phe-He-Val-ArK-Glv-Arg-Pro-Val-Gly-Gly-Ile-Gln-His

ill). Met—Thr—Ala—LEU—LEU—Агк—VAL—ILE—Ser—LEU—UAL—VAL—ILE—Ser—VAL—VML— VAL-ILE-ILE-ILE-Pro-PTQ-Cvs-Glv-Ala-Ala-Leu-Glv-Are-Glv-Lys-Ala

Рис. 15.23. Аминокислотные последовательности лидерных полипептидов, предсказанные на основании нуклеотидных последовательностей пяти оперонов биосинтеза аминокислот ?. coli и S. typhitnurium.

(рис. 15.22). В этом случае может образоваться структура 2 :3, предотвращающая возникновение альтернативной структуры 3:4. То есть «торможение» рибосомы препятствует формированию терминаторной структуры и позволяет РНК-полимеразе продолжить транскрипцию за лидерный участок ДНК и тем самым достигнуть области структурных генов оперона. С другой стороны, в присутствии значительных количеств триптофана и соответственно триптофанил-тРНКТгр рибосома не задерживается в области соответствующих кодонов и тем самым не дает возможности образоваться петле 2; 3. Это в свою очередь делает возможным формирование терминаторной петли (3 :4) после того, как произойдет транскрипция соответствующего участка лидерной последовательности ДНК (рис. 15.22). Образование терминаторной петли вызывает обрыв транскрипции на участке, содержащем подряд несколько уридиновых остатков (отмечен на рис. 15.21).

Данная модель аттенуации применима и к другим оперонам биосинтеза аминокислот. В каждом случае определенные кодоны располагаются в лидерном транскрипте таким образом, что задержка рибосомы, связанная с нехваткой соответствующих аминокислот, так влияет на вторичную структуру образующегося транскрипта, что формирование терминаторной петли становится невозможным.

Эта модель подтверждается экспериментами по изучению in vitro ? транскрипции фрагментов ДНК, содержащих лидерную часть trp-onepo-на. Эти эксперименты показали, что РНК-полимераза на некоторое время задерживается около нуклеотида в положении 90 образующегося транскрипта (см. рис. 15.21), прежде чем продолжить транскрипцию оставшейся части лидерной последовательности. Такая задержка может быть связана с образованием шпильки 1 :2 за ферментом. Вероятно, благодаря возникшей паузе первая рибосома успевает начать трансляцию и «догнать» РНК-полимеразу.

Тесное сопряжение процессов транскрипции и трансляции может объяснить полярные эффекты nonsense-мутаций. В норме рибосомы следуют непосредственно за РНК-полимеразой, направляя трансляцию образующихся участков мРНК «по мере поступления». При введении nonsense-мутаций на участке, где в норме трансляция должна продолжаться, возникает стоп-кодон, рибосомы отделяются от новообразованной мРНК и более не следуют за РНК-полимеразой. Имеются некоторые указания на то, что криптические терминаторные последователь

ности содержатся во многих структурных генах. Считают, что, когда рибосомы перестают следовать за РНК-полимеразой, эти криптические последовательности могут формировать терминаторные шпильки в новообразованной мРНК, что вызывает остановку транскрипции до завершения считывания всего оперона. В норме продвижение рибосом по образующейся цепи мРНК предотвращает формирование этих термина-торных шпилек.

Антитерминационный белок N фага X, вероятно, проявляет свою активность, оказывая влияние на взаимодействие рибосом с РНК-полимеразой. Вспомните, что белок N действует на участках nut (также формирующих шпильки в структуре образующихся мР