НК), модифицируя РНК-полимеразу таким образом, что она после этого перестает «замечать» большинство терминаторных последовательностей. Отбор мутантов E.coli, в которых белок N оказывается нефункциональным, позволил выявить существование клеточного гена nus А (от англ. N undersupplied). Белок, продукт этого гена, входит в состав активного транскрипционного комплекса, образуемого РНК-полимеразой (см. гл. 11). Считают, что мутация nus А изменяет этот белок таким образом, что он становится нечувствительным к действию белка N. Это свидетельствует о том, что белок N на участке nut модифицирует РНК-полимеразу за счет непосредственного взаимодействия с белком nus А.

Очевидно, что процесс терминации транскрипции весьма сложен. Анализ влияния различных мутаций на протекание таких сложных процессов даст возможность определить круг ферментов, участвующих в них, сформулировать модели соответствующих механизмов. Этот и другие рассмотренные нами примеры иллюстрируют широкие возможности генетического анализа.

Регуляция экспрессии генов

с помощью сайт-специфической

рекомбинации

Рассмотренные примеры механизмов генетической регуляции основаны на использовании перечисленных в начале этой главы типов регуляторных элементов - белков-регуляторов, низкомолекулярных эффекторов и регуляторных центров. Однако следует отметить, что этим списком не исчерпываются регуляторные возможности прокариот.

Так, бактерии рода Salmonella обладают жгутиками, используемыми для передвижения. Эти жгутики содержат один основной структурный белок-флагеллин; однако бактерии обладают двумя структурными генами, которые кодируют два иммунологически различных типа флагел-линов. Два соответствующих белка обозначают HI и Н2. Структурные гены этих белков не являются тесно сцепленными. В клетках всегда экс-прессируется только какой-либо один из них. Ген Н2 тесно сцеплен и экспрессируется синхронно с геном гН1, продукт которого служит ре-прессором гена HI. Таким образом, при экспрессии пары Н2, гН1 синтезируется только флагеллин Н2, поскольку репрессор гН1 предотвращает экспрессию гена HI. Напротив, при подавлении экспрессии Н2 и гН1 происходит синтез флагеллина HI. Явление альтернативной экспрессии

Рис. 15.24. Доказательство наличия спонтанно инвертируемой последовательности в ре-гуляторной области оперона Н2-гН1. А. Плазмиду, содержащую клонированную регуляторную область оперона, размножают для получения большой популяции плаз-мидных молекул, которые затем линеаризуют обработкой рестриктазой Eco RI (плазмида содержит единственный сайт для Eco RI). Далее проводят денатурацию ДНК и отжиг. Б. Образовавшиеся гетеродуплексные молекулы ДНК анализируют с помощью электронного микроскопа. О-образный участок негомологии,

обнаруживаемый в составе некоторых гете-родуплексных молекул ДНК, свидетельствует о спонтанной инверсии, имеющей место в ходе роста плазмидной популяции. (По Zieg J. et al, 1977. Science 196, 170.) [Copyright 1977 by the American Association for the Advancement of Science.]

1' 3'

2 4

~--2, 4,

5 5'

Отжиг

1 3

3' 5' ;

2 4 1' 2'

5 4'

Н2

Флнп

Флоп

<— Выключен

? < < ?

Н2

Рис. 15.25. Модель фазовой вариации, основанная на представлении об инверсии нуклеотидной последовательности, содержащей промоторную область оперона Н2-гН1. (По ZiegJ. et al, 1977. Science, 196, 170.)

генов HI и H2 получило название вариации фаз. В культуре, выращенной из клетки, находившейся в какой-либо одной из двух фаз, всегда обнаруживаются клетки в обеих фазах. Частота перехода клеток из одной фазы в другую для различных штаммов Salmonella варьирует в пределах от 1 на 105 до 1 на 103 клеток за генерацию. Вариация фаз для бактерий Salmonella, вероятно, является одним из способов избежать иммунологического отторжения в ходе инфекции.

Контроль вариации фаз зависит от состояния промотора, направляющего транскрипцию генов Н2 и гН1. Это было показано с помощью клонирования соответствующей регуляторной области на плаз-мидном векторе с использованием методов, описанных в гл. 9. При выращивании клеток E.coli, содержащих плазмиду со встроенной регуляторной областью, можно получить огромную популяцию идентичных молекул. Плазмидную ДНК очищают и линеаризуют с помощью ре-стриктазы Есо RI (рис. 15.24). Денатурация и отжиг цепей ДНК приводит к образованию гетеродуплексов, содержащих цепи из различных исходных плазмидных молекул. Некоторые из этих гетеродуплексных молекул содержат негибридизующийся участок протяженностью около 800 п. н. (рис. 15.24). Появление этого участка, как оказалось, вызвано тем, что в некоторых плазмидах произошла переориентация участка протяженностью 800 п. н. Это наблюдение позволило предложить модель механизма вариации фаз, согласно которой промотор генов Н2 и гН1 может находиться в одной из двух ориентации («флип» или «флоп»). В одной из них транскрипция с этого промотора приводит к образованию белков Н2 и гН1. При другой ориентации транскрипции этих генов не происходит (рис. 15.25).

Было показано, что инверсия промоторной области у Salmonella направляется системой сайт-специфической рекомбинации. По обе стороны от инвертируемого участка находятся идентичные противоположно ориентированные сегменты последовательности ДНК по 14 п. н. Наряду с промотором генов Н2 и гН1 этот участок содержит также ген (hin), продукт которого направляет сайт-специфическую рекомбинацию между 14-членными повторами. В результате рекомбинации происходит инверсия всего этого участка ДНК. Фаги Р1 и Ми также кодируют белки сайт-специфической рекомбинации, которые могут направлять инверсию сегментов ДНК в их собственных геномах. Оказалось, что эти белки могут заменить дефектный белок Hin в мутантах Salmonella hin ~.

Это позволяет предположить, что подобные системы инверсии последовательностей, участвующих в регуляции экспрессии генов в различных геномах, произошли от общего предшественника.

Регуляция экспрессии генов посредством сайт-специфической инверсии, вероятно, не является широко распространенным способом генетической регуляции у прокариотических организмов. Судя по всему, эволюция большинства регуляторных механизмов прокариот была направлена на создание систем быстрого изменения уровня экспрессии тех или иных генов в ответ на быстрые изменения в окружающей среде. В то же время система вариации фаз организована таким образом, что соответствующие изменения происходят с очень низкой вероятностью и не могут служить целям быстрого реагирования на изменения окружения. Система сайт-специфической инверсии скорее предназначена не для оперативной подстройки к изменяющимся условиям среды, а для подготовки целой популяции клеток к встрече с новыми условиями окружения посредством расширения возможностей генетической вариабельности в популяции.

Литература. -у- •^^?^^-?•y^Dickson R.C. et al. (1975). Genetic regulation: the

lac control region, Science, 187, 27-35. Farabaugh P. J. (1978). Sequence of the lac I gene,

Nature, 274, 765-769. Friedman D.I. et al. (1981). Evidence that

ribosomal protein S10 participates in control of

transcription termination, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 78, 1115-1118. Gilbert W., Maxam A. (1973). The nucleotide

sequence of the lac operator, Proc. Natl. Acad.

Sci. USA, 70, 3581-3584. Guarente L. et al. (1982). Mutant X phage repressor

with a specific defect in its positive control

function, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,

2236-2239.

Herskowitz I. (1973). Control of gene expression in bacteriophage lambda, Annu. Rev. Genet., 7, 289-324.

Herskowitz I., Hagen D. (1980). The lysis-lysogeny decision of phage X: explicit programming and responsiveness, Annu. Rev. Genet., 14, 399-445.

Johnson A. et al. (1978). Mechanism of action of the его protein of bacteriophage lambda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1783-1787.

Johnson A. D. et al. (1981). X repressor and его-components of an efficient molecular switch, Nature, 294, 217-223.

Matthews B. W. et al. (1982). Structure of the DNA-binding region of lac repressor inferred from its homology with cro repressor, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1428-1432.

Ogata R., Gilbert W. (1978). An amino-terminal fragment of lac repressor binds specifically to lac operator, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 5851-5854.

Olson E.R., FlammE.L., Friedman D.I. (1982).

Analysis of nutR: a region of phage lambda

required for antitermination of transcription,

Cell, 31, 61-70. O'Neill M. C, Amass K., de Crombrugghe B.

(1981). Molecular model of the DNA interaction

site for the cyclic AMP receptor protein, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2213-2217. PaboC.O. et al. (1979). The lambda repressor

contains two domains, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA, 76, 1608-1612. Ptashne M. et al. (1980). How the X repressor and

cro work, Cell, 19, 1-11. Shimatake H., Rosenberg M. (1981). Purified

X regulatory protein dl positively activates

promoters for lysogenic development, Nature,

292, 128-132. Siebenlist U. et al. (1980). E. coli RNA polymerase

interacts homologously with two different

promoters, Cell, 20, 269-281. Ward D.F., Gottesman M.E. (1982). Suppression

of transcription termination by phage lambda,

Science, 216, 946-951. Yanofsky C. (1981). Attenuation in the control of

expression of bacterial operons, Nature, 289,

751-758.

Zieg J. et al. (1978). Regulation of gene expression by site-specific inversion, Cell, 15, 237-244.

Ключевые слова и понятия

Активатор

Аллостерический переход

Аттенуатор

Аттенуация

Белок активатор катаболитных генов

(САР-белок) Белок-негативный регулятор Белок - позитивный регулятор Вариация фаз Гены

Индукция фермента Индуктор

Катаболитная репрессия Конститутивный мутант Корепрессор

Лизис или лизогения

Обобщенная последовательность

Оператор

Оперон

Палиндром

Полярный эффект

Прибнов-бокс

Промотор

Регуляторный белок

Регуляторный центр

Репрессор

Терминатор

Сопряженная транскрипция - трансляция

Шпилька

Эффектор

Задачи

15.1. Прокариотические