Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

анием интронов из соответствующих первичных РНК-транскриптов, то есть сплайсингом. Контроль экспрессии генов

Экспрессия генетического материала Таблица 16.1. Возможные уровни регуляции экспрессии генов

Уровни регуляции

Ядерный Транскрипция Инициация

Терминация (аттенуация) Процессинг ядерной РНК

Полиаденилирование

Сплайсинг Цитоплазматический Стабильность мРНК

Эффективность трансляции мРНК

Количество примеров

Множество, >>100 1

~ 3 2

~5 на уровне определенных генов; множество на общем уровне. ~10 на уровне определенных генов; множество на общем уровне.

Составлено по DamellJ.E., Ir. 1982. Nature, 297, 365.

может осуществляться как на уровне самой транскрипции, так и на уровне сплайсинга. Более того, ДНК в эукариотических клетках организована в нуклеосомы, которые в свою очередь формируют хромати-новые структуры более высокого порядка (см. гл. 4). В зависимости от локальной структуры хроматина данные участки ДНК могут находиться в состоянии, доступном или недоступном для действия РНК-полимеразы, то есть структура хроматина также может влиять на регуляцию транскрипции. В табл. 16.1 приведены возможные уровни регуляции эукариотических генов и сведения о количестве примеров, на которых удалось показать реализацию того или иного уровня регуляции. Кроме того, так как у эукариот транскрипция не сопряжена непосредственно с трансляцией, то возможен и фактически реализуется цитоплазматический контроль использования регуляторных мРНК. Все эти контролирующие и регуляторные механизмы, без сомнения, требуют участия специализированных белков (и, возможно, некоторых молекул РНК), действующих на соответствующие регуляторные участки ДНК или РНК. В настоящее время сведения о природе этих регуляторных молекул весьма ограничены. Однако есть основания полагать, что в ближайшие годы наши представления в этой области могут существенно расшириться.

Участки ДНК, контролирующие транскрипцию

По аналогии с прокариотами можно ожидать, что в инициации транскрипции эукариотических генов должны участвовать промоторные последовательности, расположенные в ДНК недалеко от точки инициации синтеза РНК (с 5'-конца данного гена). С использованием методов, описанных в гл. 9, удалось клонировать значительное количество структурных генов из различных эукариотических клеток и их вирусов. Сравнение 5'-фланкирующих последовательностей этих генов позволило выявить очень характерную А-Т-богатую последовательность, распо1 2 3 4 5 6 7

Обобщенная последовательность

Рис. 16.1. Сравнение 5'-фланкирую-щих последовательностей для 41 эукариотического гена. Цифровые индексы соответствуют числу случаев, в которых данный нуклеотид занимает данное положение в некоди-рующей цепи ДНК (то есть в той, которая комплементарна цепи, служащей матрицей для синтеза РНК). Соотнесение последовательностей осуществлено по принципу получения

максимального сходства, поэтому, как отмечено в верхней строке, наблюдаются определенные различия в расстояниях между данным нуклео-тидом и точкой начала транскрипции (первый транскрибируемый нуклеотид имеет номер +1). Внизу приведена обобщенная (consensus) или так называемая ТАТА-последовательность. (По Corden I. et al, 1980. Science 209, 1406.)

лагающуюся, как правило, за 20-30 нуклеотидов до точки начала транскрипции. Этот участок, названный Гольдберг-Хогнесс-боксом (по аналогии с Прибнов-боксом прокариот) или просто «ТАТА»-последова-тельностью, показан на рис. 16.1. Наличие такой последовательности характерно для транскрипционных единиц, в считывании которых участвует РНК-полимераза II.

Изучали способность клонированных генов, включающих 5'-фланки-рующие последовательности, направлять транскрипцию in vitro и in vivo с использованием тест-систем, позволяющих оценивать точность инициации транскрипции в 5'-концевой области клонированных последовательностей. Таким образом, при работе с клонированными му-тантными и нормальными ДНК удается провести сравнение, позволяющее установить, какие из остатков 5'-фланкирующей последовательности действительно необходимы для нормального функционирования промотора. Эти исследования показали, что ТАТА-последовательность необходима для правильного выбора цепи ДНК и точки инициации транскрипции. Эта регуляторная последовательность наряду с другими участками последовательности контролирует также эффективность инициации транскрипции.

Для осуществления точной транскрипции in vitro недостаточно присутствия только очищенной РНК-полимеразы II и клонированной последовательности ДНК. Необходимо также присутствие неидентифици-рованных в настоящее время белков. Была разработана кроме того удобная система транскрипции in vivo, основанная на инъекции клонированной ДНК в очень крупные ядра ооцитов африканской шпорцевой лягушки Xenopus. Инъецированная ДНК связывается с гистонами

Рис. 16.2. Мутагенез in vitro используется для выявления 5'-фланки-рующих последовательностей, участвующих в контроле транскрипции. На стадии 1 ре-стрикционный фрагмент ДНК, содержащий ген tk, подвергают расщеплению с обоих концов экзону-клеазой III и нуклеа-зой SI. Образующиеся продукты расщепления для большей наглядности изображены здесь в виде двух наборов дискретных 5'-и З'-концевых фрагментов. В действительности, индивидуальные фрагменты как таковые идентифицируют только после клонирования и определения нуклеотидной последовательности, как показано на схеме (стадии 2 и 3). На стадии 2 к концам каждого из фрагментов в смеси присоединяют Ват HI-линкеры и проводят встраивание в вектор pBR322 по Ват Щ-сай-ту. После этого индивидуальные фрагменты могут быть получены с помощью клонирования рекомбинантных плазмид в Е. coli, как обсуждалось в гл. 9 (стадия 3).

Мутагенез in vitro с введением линкерных вставок

Кодирующая область

•3'

•5'

ДНК нормального гена tk

Регуляторная область

Нуклеаза S1

Стадия

Экзонуклеаза III

Экзонуклеаза III удаляет нуклеотиды с З'-конца

tt

Нуклеаза S1 атакует одноцепочечную ДНК

Набор 5'-концевых фрагментов, содержащих дистальные участки регуля торной области

Стадия 2

К концам фрагментов каждого набора присоединяют линкер, содержащий 10 п.н. (в данном случае Ват НГ линкер) и включающий сайт рестрикции, отсутствующий в ДНК гена tk дикого типа

Все фрагменты расщепляют рестриктазой 8am HI для создания липких концов и клонирования в векторе pBR322 по Sam HI-сайту

Стадия 3

Клонирование позволяет выделить индивидуальные фрагменты в чистом виде и идентифицировать их с помощью определения нуклеотидной последовательности

Стадия 4

Рекомбинацией in vitro индивидуальных фрагментов из 5 -концевого и 3 -концевого наборов по Ват HI-сайту можно получить целый ряд различных мутантных генов tk

Регуляторная область | Кодирующая область

и образует нуклеосому, имитирующую естественный субстрат для транскрипции в ядре.

Хорошим примером применения такого подхода является мутационное картирование регуляторных последовательностей, необходимых для транскрипции гена тимидинкиназы (tk) вируса герпеса. Этот ген может

120 -100 ~80 -60 -40 -20 cap 20

I I ( I I I I I I I I I I I ir

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG ACGTCCACTT CGCATATTAA GCTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC I cH ДИКОГО

типа

CCCGGATCCG GCAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCCCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -I19/-KW

CTATGCCGGA TCCGGCCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCCCGGTCCG ACCTCCACTT CGCATATTAA GCTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -115/-105

CTATGATGAC CGGATCCGGG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCCGTCCG ACCTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC Lb -1U/-101

CTATGATGAC ACAAACCGGA TCCGCCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -105/-95

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCCGCA TCCGGTTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -95/-8S

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATCCGG ATCCGGGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG ACGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -*4/-74

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC CCGGATCCGG ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -Ю/-70

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC CCCGGATCCG GCGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG ACGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -79/-69

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC CCGGATCCGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -70/-6I

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC ACCGGATCCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -53/-49

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCCCCGAT CCGGGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -5t>/-4t>

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCCCGaTC CGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -47/-37

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG GGATCCGGTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -43/-33

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CCCGGATCC GCTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -29/18

С

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG ACGTCCACTT CGC AT A TTAC GG AT CCGGGT GTGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC LS -2I/-12

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGCCGGAT CCGGCCTCGA ACACCGAGCG ACCCTGCAGC L5 -16/-6

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC

страница 44
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(18.09.2019)