Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG ACGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGCCGGATC CGGCCGAGCG ACCCTGCAGC LS -7/ + 3

CTATGATGAC ACAAACCCCG CCCAGCGTCT TGTCATTGGC GAATTCGAAC ACGCAGATGC AGTCGGGGCG GCGCGGTCCG AGGTCCACTT CGCATATTAA GGTGACGCGT GTGGCCTCGA ACACCCCGG ATCCGGCAGC LS +5/+ 15

Рис. 16.3. Мутантные гены tk, полученные, как показано на рис. 16.2. Нормальная последовательность соответствующей области гена tk приведена в верхней строке (показана только последовательность некодирующей цепи). Встраивание в эту последовательность Ват HI-линкера на различных участках приводит к возникновению нуклеотидных замен, выделенных цветом. Эффективность транскрипции для каждого из мутантных генов указана в табл. 16.2 (По McKnightS.L, Kingsbury Я, 1982. Science 217, 316.)

экспрессироваться во многих типах эукариотических клеток, о чем свидетельствует инфекционная активность вируса по отношению к широкому спектру эукариотических организмов, а также способность воспроизводиться в соматических клетках многих типов тканей. Во всех случаях на 5'-конце РНК-транскрипта гена tk обнаруживается одна и та же последовательность, что указывает на способность промотора tk функционировать идентично в разных типах эукариотических клеток.

Для идентификации в 5'-фланкирующей последовательности нуклеотидов, вовлеченных в регуляцию транскрипции гена tk, можно было бы вводить мутации в каждое положение. Такой подход оказался бы чрезвычайно трудоемким. Более эффективный метод, названный лин-керным сканированием, был использован в работе Мак-Найта и его коллег. Этот метод (рис. 16.2) включает создание в клонированном гене tk двух наборов делеций-с левого и с правого конца клонированной последовательности. Протяженность делеций в каждом делеционном варианте фиксировали с помощью определения нуклеотидной последовательности. Были получены 43 различные делеций с 5'-конца и 42-с З'-конца, вошедшие в состав мутагенизированных таким образом генов tk (рис. 16.2). С использованием подходящих делеционных мутантов из каждого набора можно было сконструировать гены, содержащие мутации замещения и отличающиеся от нормальной последовательности tk в десяти или менее положениях нуклеотидных пар. Некоторые из этих мутантных последовательностей показаны на рис. 16.3.

В каждом случае влияние замещения определенных участков последовательности на эффективность транскрипции определяли, инъецируя очередную конструкцию, состоящую из клонирующего вектора pBR322 со встроенным мутантным геном tk, в ядра ооцитов Xenopus. После 24 часов инкубации из ооцитов экстрагировали суммарную РНК и определяли в ней содержание и структуру транскрипта гена tk. Результаты, представленные в табл. 16.2, позволяют выявить три участка в 5'-флан-кирующей последовательности, необходимые для эффективной транскрипции гена tk (отмечены на рис. 16.4). Более того, оказалось, что участок, расположенный ближе других к точке инициации и содержащий

Вторая дистальная последов ателькость

ТАТА-последовательность, необходим для точного выбора начальной точки транскрипции. Изменения в этом участке приводят к тому, что транскрипция инициируется на других нуклеотидах и с гораздо более низкой частотой.

Рассмотренные эксперименты убедительно свидетельствуют о том, что район, содержащий ТАТА-последовательность, образует функционально важные контакты с РНК-полимеразой II, необходимые для ориентации фермента в положении, позволяющем ему начать транскрипцию с правильной точки. Точное функциональное значение более отдаленных участков, отмеченных на рис. 16.4, представляется не столь очевидным. Соблюдение фиксированного расстояния между дистальны-ми участками и ТАТА-последовательностью не является необходимым условием эффективной транскрипции (вспомним, что расстояние между участками —10 и — 35 в прокариотических промоторах, напротив, является критическим). Об этом свидетельствуют результаты экспериментов, отраженные на рис. 16.5. Транскрипционная активность некоторых мутантов указывает на то, что РНК-полимераза II не образует контактов с дистальными последовательностями и ТАТА-последовательностью одновременно и что другие компоненты, влияющие на транскрипцию, не имеют специфического сродства к дистальным участкам, а вступают во взаимодействие с РНК-полимеразой, зафиксированной в области ТАТА-последовательности. Если бы такие контакты были необходимы, то изменение расстояния между соответствующими участками (см. рис. 16.5) оказывало бы существенное влияние на эффективность транскрипции. Возможное функциональное значение ди-стальных последовательностей будет обсуждаться в дальнейшем.

Терминация транскрипции считываемых РНК-полимеразой II транскрипционных единиц происходит по-разному в зависимости от организма и от конкретной последовательности. Так, в дрожжах механизм терминации заметно отличается от соответствующего механизма у высших эукариот. За исключением гистоновых мРНК, все молекулы мРНК модифицированы с 3'-конца добавлением polyA-хвоста. Сравнение З'-концевых участков ряда мРНК позволило выявить наличие универсальной последовательности AAUAAA или очень близкой к ней на расстоянии около 15 нуклеотидов от точки полиаденилирования (рис. 16.6). Эта последовательность отсутствует не только в гистоновых мРНК высших эукариот, но и во всех дрожжевых мРНК. С помощью мутагенеза in vitro было показано, что эта последовательность выступает в роли сигнала полиаденилирования новообразованных РНК-транскриптов. Делеция этой последовательности приводит к образованию аномально

? + » + + Рис. 16.5. Мутантные гены tk с систематически изменяющимися расстояниями между первой и второй дистальной последовательностями и последовательностью TATA, полученные с помощью введения делеций или вставок чужеродных фрагментов в ДНК гена дикого типа. Для каждого мутанта указан размер удаленного (— ) или встроенного ( + ) фрагмента ДНК в нуклеотидных парах. Справа приведены данные по оценке эффективности транскрипции мутантных генов

в ооцитах Xenopus по сравнению с эффективностью для гена tk дикого типа: (+ 4-)-означает уровень транскрипции, сопоставимый с нормальным; (4- —)-10-20% от нормального уровня транскрипции; (— —)-менее 10% от нормального; (+ 4-4-)-транскрипционная активность в пять раз выше нормальной, дп-дистальная последовательность, пп-проксимальная последовательность (По McKnightS.L, 1982. Cell, 31, 355.)

длинного транскрипта, полиаденилирование которого происходит после следующего аналогичного сигнала, входящего в состав следующего считываемого сегмента ДНК. Сигнал AAUAAA может находиться на значительном расстоянии от истинной точки терминации транскрипции. В случае р-глобинового гена млекопитающих сигнал полиаденилирова-ния расположен на расстоянии 1400 нуклеотидов от З'-конца транскрипта, а истинная природа собственно терминаторного сигнала неизвестна. Очевидно, что расщепление первичного транскрипта РНКазами до сайта полиаденилирования является частью созревания мРНК. С другой стороны, в клетках дрожжей процесс полиаденилирования является частью процесса истинной терминации транскрипции на терминаторной последовательности, структура которой еще не установлена.

Истинные терминаторные последовательности были идентифицированы в транскрипционных единицах гистоновых генов. Сравнение З'-концов гистоновых мРНК ряда высших эукариот позволило выявить весьма характерную последовательность, содержащую инвертиро16

а-Глобии

U-G-G-U-C-U-U-U-G-A-A-U-A-A-A-G-U-C-U-G-A-G-U-G-A-G-U-G-G-C-poly{A) кр0лика 20

U-G-G-C-U-A-A-U-A-A-A-G-G-A-A-A-U-U-U-A-U-U-U-U-C-A-U-U-G-C-poly(A) кролика"

16

U-G-G-U-C-U-U-U-G-A-A-U-A-A-A<^U-C-U-G-A<^U-G-G-G-C-G-G-C-poly(A) 20

U-G-C-C-U-A-A-U-A-A-A-A-A-A-C-A-U-U-U-A-U-U-U-U-C-A-U-U-G-C-poly(A) 0-Гл°бин

г человека

18

Легкая цепь

A-A-U-A-U-U-C-A-A-U-A-A-A-G-U-G-A-G-U-C-U-U-U-G-C-A-C-U-U-G-poly(A) иммуноглобулина мыши

14

C-C-U-U-U-A-A-U<>A4J-A-A-U-A-A-^^^

Рис. 16.6. Участки последовательности различных мРНК, предшествующие области посттранскрипционного полиаденилирования. Выделены сегменты, выступающие в роли сигналов полиаденилирования (По Proudfoot N. I., Brownlee G.G., Nature, 263, 211.)

ванные повторы и способную образовывать шпилечную структуру, которая напоминает структуру терминаторов у прокариот (рис. 16.7). Мутагенез in vitro клонированного гена гистона морского ежа и анализ транскриптов, образующихся после инъекции мутантных генов в оо-циты Xenopus, показали, что последовательности ДНК, участвующие в образовании шпилечной структуры, а также концевая последовательность АССА необходимы для правильной терминации транскрипции. В то же время удаление участков ДНК, следующих за АССА-последова-тельностью, также приводит к аномальной терминации. Это означает, что наличие общей последовательности, изображенной на рис. 16.7, является необходимым, но не достаточным условием нормальной терминации.

В эукариотических клетках присутствуют и две другие РНК-полимеразы. Полимераза I отвечает за транскрипцию рибосомных РНК. Из-за

Рис. 16.7. З'-Концевые области гистоновых мРНК содержат показанную на рисунке характерную последовательность, способную к формированию шпилечной структуры за счет образования водородных связей между нуклеотидами, помеченными стрелками (По Birchmeier С, Grosschedl R., Birnstiel M.L., 1982. Cell, 28, 739.)

AACGCC^CTTTTCAG^GCCACCA 3'

T^ ^A

т т т с

Т-А C-G C,T-A,G C-G G-C G-CAAC ACCAqh

высокой скорости процессинга первичных рибосомальных РНК-транскриптов практически невозможно определить сайты истинной инициации транскрипции. Поэтому структура промоторных последовательностей, узнаваемых РНК-полимеразой I, еще не установлена. РНК-полимераза III участвует в транскрипции сравнительно небольшого числа генов. Среди них гены тРНК и рибосомальных 5SPHK. Полимераза III транскрибирует также некоторые небольшие вирусные гены, входящие в семейство повторов, называемых ЛЬ-повторами, широко распостра-ненных в ДНК многих приматов. Функциональное значение семейства Л/ы-транскриптов пока неизвестно. Для выявления регуляторных последо

страница 45
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(24.10.2019)