Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

оответствующего интрона, способствующим его удалению. (По Ohshima Y et al, 1980. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78, 4471.)

Транскрипция и структура хроматина

Гигантские молекулы ДНК в ядрах эукариотических клеток чрезвычайно плотно упакованы в хроматиновую структуру, которая представляет собой иерархическую систему сверхспирализации нуклеосомно-связан-ной ДНК. Образование спиралей высших порядков, которые описывались в гл. 4, несомненно, делают ДНК недоступной для действия транскрипционного аппарата клетки. Процесс транскрипции связан с определенными изменениями в структуре хроматина.

Клонированные фрагменты ядерной ДНК могут быть использованы в качестве радиоактивных зондов для изучения изменений в структуре хроматина, которыми сопровождается транскрипция соответствующих генов. Об изменениях в структуре хроматина в области интенсивно транскрибируемых последовательностей свидетельствует их повышенная чувствительность к расщеплению ДНКазой I. О способах обнаружения такого рода структурных изменений подробнее рассказывается в Дополнении 16.1.

Считают, что повышение чувствительности к ДНКазе I в области активных генов связано с образованием открытых участков хроматина. Даже на таких открытых участках ядерная ДНК остается все же более устойчивой к действию ДНКазы, чем свободная ДНК, вероятно, за счет сохранения связи с нуклеосомами. Размер открытых участков хроматина, которые в большей степени, чем компактные участки, доступны действию ДНКазы, может достигать нескольких тысяч нуклеотидных пар. Это означает, что так называемые хроматиновые домены по размеру значительно превышают обычные транскрипционные единицы.

Экспериментальные приемы, описанные в Дополнении 16.1, были использованы также для изучения структуры хроматина внутри активных доменов. При обработке ядер даже небольшими количествами ДНКазы I в структуре открытых участков удается выявить наличие гиперчувствительных областей. С помощью радиоактивных зондов, полученных на основе очень небольших рестрикционных фрагментов из различных участков определенного гена, удалось установить, что гнперчувстви-тельные области располагаются в 5'-фланкирующей последовательности ДНК активной транскрипционной единицы. Так, гиперчувствительный участок, прилегающий к гену tk вируса герпеса, локализуется в области от — 4 до — 182 п. н. (см. рис. 16.4), включая как ТАТА-последовательность, так и дистальные последовательности, необходимые для инициации транскрипции. Было установлено, что наличие гиперчувствительных к ДНКазе участков в 5'-концевой области транскрипционной единицы является характерной особенностью активно транскрибируемых генов. По крайней мере в некоторых случаях эти участки оказываются также чувствительными к действию эндонуклеазы S1, расщепляющей одноцепочечную ДНК, что указывает на возможность возникновения в гиперчувствительной области неканонических структур ДНК.

Дополнение 1.6.1, Исследование структуры хроматина

Структуру участков хроматина, содержащих гены, клонированные в составе рекомбинантных векторных ДНК, можно изучать непосредственно на интактных ядерных ДНК, в качестве критерия используя различия в чувствительности к действию нуклеаз. Участки ДНК, входящие в область «открытых» хроматиновых структур, более доступны нуклеазной атаке, чем участки, существующие в виде более компактных структурных образований.

Для обнаружения таких участков ДНК проводят мягкое разрушение клеток, не сопровождающееся разрушением ядер. Аликвоты ядерной фракции подвергают действию возрастающей дозы нуклеазы типа ДНКазы I, которая вносит одноцепо-чечные разрывы в двухцепочечную ДНК. После этого из каждой аликвоты выделяют ДНК и подвергают ее расщеплению определенной рестриктазой. Полученные препараты анализируют с помощью электрофореза и гибридизации по Саузерну

Рис. 16.11. Обнаружение участков хромати-новой ДНК, чувствительных к расщеплению ДНКазой I. Ре-стрикционный фрагмент, выявляемый по гибридизации с зондом 1, устойчив к ДНКазе I, вероятно, ввиду защитного действия структуры соответствующего участка хроматина. Напротив, другой рестрик-ционный фрагмент, гибридизующийся с зондом 2, чувствителен к действию ДНКазы I. С увеличением концентрации фермента в реакционной смеси количество соответствующего фрагмента убывает.

3. Расщепление О

ДНКазой I (мкг/мл)

4. Выделение ДНК и расщепление рестриктазой

5. Анализ набора фрагментов ДНК с помощью электрофореза в геле, переноса по Саузерну и гибридизации с радиоактивными зондами 1 и 2

6. Радиоавтография

0,2 0,4 0,6

ДНКаза 1 (мкг/мл)

Зонд 2

(см. гл. 9). В качестве зонда для локализации искомых рестрикционных фрагментов после электрофореза используют клонированные радиоактивно меченные фрагменты соответствующих генов.

Обработка ДНКазой I не приводит к изменению положения рестрикционного фрагмента ДНК на электрофореграмме, поскольку точки расщепления ДНКазой I случайным образом распределены по обеим цепям ДНК. Если участок ДНК оказывается доступен действию ДНКазы I (как в случае участка, комплементарного зонду 2, рис. 16.11), то при увеличении концентрации ДНКазы количество фрагмента в пробе и интенсивность сигнала на радиоавтограмме падают. Такое поведение характерно для транскрипционно активных областей ДНК. Участок ДНК, фрагмент которого гибридизуется с зондом I, ведет себя в данных экспериментах аналогично участкам, расположенным в неактивной области ядерной ДНК: количество фрагмента с увеличением концентрации ДНКазы I практически не меняется, поскольку соответствующий участок недоступен действию фермента.

Таким образом, рассмотренные выше подходы надежно свидетельствуют о существовании в хроматине гиперчувствительных областей ДНК. Они позволяют также выявить корреляцию между транскрипцией и возникновением гиперчувствительных участков вблизи точки инициации транскрипции. В то же время следует помнить, что обнаружение корреляции еще не означает установления точной причинно-следственной связи событий. Лишь в некоторых случаях с помощью генетического анализа удалось показать, что последовательности гиперчувствительных участков ДНК действительно необходимы для инициации транскрипции. Наиболее интересен пример транскрипции гена Sgs4 Drosophila, о котором упоминалось в гл. 9. В 5'-фланкирующей и структурной областях этого гена было выявлено пять гиперчувствительных участков (рис. 16.12). Эти участки обнаруживаются только в ДНК, выделенной из ядер клеток слюнной железы в стадии развития, сопровождающейся активной экспрессией гена Sgs4. Известны мутанты, которым не свойственна экспрессия этого гена. Соответствующие мутации картируются в 5'-фланкирующей области гена. У двух типов мутантов делегированы наиболее удаленные гиперчувствительные участки ДНК (рис. 16.12). В случае наиболее отдаленной делеций (Вег) налицо практически полное отсутствие транскрипции гена Sgs 4. В хроматине клеток слюнной железы у мутантов Вег обычными методами в районе гена

480405 -33070

+30

BER

ORL

Рис. 16.12. Участки, гиперчувствительные к ДНКазе I в области 5'-конца гена Sgs 4 и в предшествующей области ДНК из ядер клеток слюнной железы Drosophila. Размеры серых кружков отражают относительную чувствительность соответствующих участков к ДНКазе I. ФиSgs 4

гурной скобкой отмечен весьма протяженный гиперчувствительный участок в области -330. Внизу отмечены две делеций, упомянутые в тексте. (По Shermoen A. W., Beckendorf S. К., 1982. Cell, 29, 601. Copyright 1982 М. IT.)

Sgs 4 не удается обнаружить гиперчувствительные участки, выявляемые в норме, в том числе и те, которые локализуются вне области делеции. Напротив, в случае делеции ORL уровень транскрипции гена Sgs 4 составляет 1-3% от нормального, а при обычном картировании гиперчувствительных участков удается выявить все, кроме участка ДНК, затронутого делецией. Очевидно, различные гиперчувствительные участки по-разному влияют на процесс транскрипции гена Sgs 4. Судя по всему, наиболее отдаленный (дистальный) участок необходим для изменения структуры хроматина в области протяженностью около 500 п. н. Наличие этого участка-необходимое условие инициации транскрипции. Второй участок в последовательности ДНК, вероятно, также требуется для нормального осуществления транскрипции, однако он едва ли непосредственно вовлечен в изменение структуры хроматина.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что так же, как и в случае прокариотических генов, участки ДНК, предшествующие последовательностям эукариотических генов, необходимы для регуляции экспрессии этих генов. Однако в отличие от прокариотических генов некоторые из этих участков могут использоваться для регуляции структуры хроматина, в то время как другие могут участвовать в регуляции структуры самой ДНК, выступая в качестве необходимых компонентов в процессе точного взаимодействия РНК-полимеразы с ТАТА-последовательностью перед началом транскрипции гена.

Был выдвинут целый ряд правдоподобных и даже взаимно не исключающих друг друга гипотез относительно функционального значения 5'-фланкирующих последовательностей. Характерно, что все они основаны на представлении об участии специфических регуляторных

с т G с

А

Рис. 16.13. Крестообразная шпилечная структура, которую может принимать 5'-фланкирующая область ДНК гена tk. Считается, что образование водородных связей между комплементарными участками первой и второй ди-стальной последовательности (см. рис. 16.4) может делать структуру такой двойной шпильки достаточно стабильной.

C-G C-G C-G G-C C-G -105 C-G -!СС CG — GG GC G-C G-C C-G G-C G-C G-C

47

белков, которые пока еще не были идентифицированы. Вышеупомянутые регуляторные гипотезы включают следующие предположения:

1. Гиперчувствительные участки ДНК могут возникать за счет действия регуляторных белков, специфически связывающихся с определенными последовательностями, вытесняющих эти последовательности из контакта с нуклеосомами. В результате структура данного участка ДНК меняется таким образом, что он становится аномально чувствительным к расщеплению ДНК-азой I.

2. Гиперчув

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.09.2019)