Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

ствительные участки могут содержать особые последовательности, которые сами по себе способствуют локальному изменению конфигурации ДНК. Так, первый и второй дистальные участки, расположенные с 5'-конца по отношению к ТАТА-последовательно-сти гена tk (рис. 16.4), содержат инвертированные повторы, которые могут формировать альтернативную крестообразную структуру (см. рис. 16.13).

3. Гиперчувствительные участки могут содержать последовательности или находиться рядом с последовательностями, которые способствуют переходу ДНК из В- в Z-форму. Такой переход будет изменять число правосторонних витков спирали и таким образом способствовать образованию открытой структуры. Этот эффект может сказываться на достаточно отдаленных участках спирали и тем самым обеспечивать необходимое изменение структуры ДНК в области инициации транскрипции.

Согласованная регуляция экспрессии генов

Несцепленные гены в клетке могут подвергаться согласованной регуляции для обеспечения эффективного ответа на такие внешние факторы, как присутствие в среде гормонов, рост ткани за счет клеточной пролиферации, стрессовые факторы, типа голодания или теплового шока. Ключ к пониманию механизмов, обеспечивающих согласованную регуляцию, может быть найден при сравнении 5'-фланкирующих последовательностей согласованно регулируемых транскрипционных единиц. Примеры, приведенные в табл. 16.3, указывают на то, что для генов, подверженных согласованной регуляции, характерно наличие сходных коротких последовательностей, расположенных на различном расстоянии от точки инициации транскрипции. В ряде случаев с помощью анализа мутантов показано, что такие общие последовательности действительно необходимы для индукции. Так, в дрожжевом гене his 4 в 5'-концевой области содержатся три очень сходных по структуре повтора, которые присутствуют также в других генах биосинтеза аминокислот. Для предотвращения индукции гена в ответ на аминокислотное голодание необходима делеция всех трех повторов, которая в то же время не сказывается на обычном конститутивном уровне экспрессии гена his 4.

Синтез небольшого числа белков в ответ на тепловой шок (выдерживание при температуре выше физиологической) является характерной защитной реакцией практически любых эукариотических клеток. В случае Drosophila гены, кодирующие такие белки, подробно охарактеризованы. 5'-Концевые области этих генов проявляют значительное структурное сходство. Обобщенная последовательность, характерная для генов этого типа, представлена в табл. 16.3. При введении одного из клонированных генов теплового шока hsp 70, содержащего неповрежденную 5'-концевую последовательность, в культуру клеток млекопитающих наблюдалась транскрипция этого гена в ответ на тепловой шок. Делеция этой последовательности предотвращает транскрипцию клонированной ДНК в ответ на тепловой шок. Более того, если с помощью рекомбинации in vitro эту последовательность вместе со всей остальной 5'-фланкирующей областью ДНК hsp 70 присоединисть к гену tk вируса герпеса, то в ответ на тепловой шок наблюдается транскрипция гена tk.

Взаимосвязь 5'-фланкирующих последовательностей, необходимых для индукции, и гиперчувствительных участков еще окончательно не установлена. Последовательность, необходимая для транскрипции гена hsp 70 в ответ на тепловой шок, расположена внутри гиперчувствительного участка перед геном. В то же время гены теплового шока Drosophila содержат гиперчувствительные участки и в отсутствие теплового шока. Таким образом, в этом случае образование открытой структуры хроматина может быть необходимым условием, но в то же время оно, вероятно, не является фактором, непосредственно активирующим транскрипцию.

Эти примеры, так же как и те, что были рассмотрены ранее, указывают на то, что 5'-фланкирующие последовательности в ряде транскрипционных единиц, вероятно, взаимодействуют с позитивными регу-ляторными элементами (по всей видимости, белковой природы). Если бы на эти последовательности действовали также отрицательные регуляторные элементы (репрессоры), то можно было бы ожидать, что по крайней мере некоторые мутации, вызывающие делеции или иные изменения в этих последовательностях, приводили бы к конститутивной транскрипции, что противоречит имеющимся фактам. Это, однако, не означает, что в эукариотических клетках вовсе не существует репрессо-ров. Данные, указывающие на участие репрессоров в регуляции экспрессии у эукариот, будут представлены в этой главе и гл. 17.

Метилирование ДНК

Единственное модифицированное основание, обычно входящее в состав эукариотических ДНК,-это 5-метилцитозин (т5С). В ДНК из разных типов эукариотических клеток метилированы от 2 до 7% остатков ци-тидина. (Единственное иск лючение - это ДНК Drosophila и некоторых других насекомых, которые практически не содержат т5С.) Почти всегда т5С встречается в составе динуклеотида CpG; частота метилирования С в паре CpG для различных организмов и типов тканей варьирует в пределах 20-80% (см. Дополнение 16.2). Этот динуклеотид представляет собой «минипалиндром», в связи с этим метилирование в одной цепи всегда сопровождается метилированием соответствующего остатка С в комплементарной цепи.

Дополнение 16.2 Анализ метилирования ДНК

В изучении состояния метилирования эукариотических ДНК важную роль сыграло обнаружение двух рестриктаз Нра\\ и Mspl, узнающих одну и ту же тетрану-клеотидную последовательность CCGG, однако по-разному реагирующих на состояние метилирования внутреннего остатка С. Метилирование этого остатка заА

Msp Нра щищает последовательность от расщепления Hpall, но не Mspl, благодаря чему удается легко тестировать метилирование определенной части динуклеотидных сайтов CpG, входящих в состав узнаваемых этими рестриктазами четверок - CCGG. Так, абсолютно неметилированная ДНК характеризуется одним и тем же

Есо RI

Есо RI3

+ 1

+2 т.п,н.

Есо RI Есо RI + Msp I

Есо RI + Нра II

Любая ткань

Любая ткань

Печень Сперма Клеточная Мозг линия

3 -|

2 1 О -1

т.п.н.

Рис. 16.14. Обнаружение метилированных последовательностей CCGG в р-глобиновом гене кролика. При расщеплении Есо RI образуется протяженный фрагмент, содержащий большую часть Р-глобинового гена, включая оба интрона (показаны белым) и 5'-фланки-рующую последовательность. Этот фрагмент после электрофореза и переноса по Саузерну регистрируется по гибридизации с радиоактивным зондом (слева). Расщепление этого фрагмента рестриктазой Mspl происходит независимо от степени метилирования содержащихся в нем последовательностей CCGG (середина). Характер расщепления этого же фрагмента рестриктазой Яра II позволяет выявить уровень тканеспецифичного метилирования CCGG-последовательностей (справа). Данный фрагмент в составе ДНК спермы полностью метилирован, о чем говорит его абсолютная нечувствительность к действию НраII. В то же время этот фрагмент, содержащийся в ДНК, полученной из культуры кроличьих клеток, неметилирован и в одинаковой степени подвержен расщеплению Mspl и Hpall. При изучении ДНК из клеток мозга и печени обнаруживается профиль расщепления, представляющий собой смесь тех, что изображены на рисунке слева и в середине. Таким образом в этих клетках имеет место неполное метилирование соответствующих последовательностей. (По Razin A., Riggs A.D., 1980. Science, 210, 604.)

профилем электрофоретического разделения фрагментов рестрикции как Hpall, так и Mspl. В то же время в случае метилирования одной или более последовательностей CCGG обнаруживаются различия в наборах рестрикционных фрагментов, полученных при обработке ДНК этими рестриктазами (рис. 16.14). Более того, если метилирование некоторого сайта в ДНК не является полным (то есть часть молекул ДНК в популяции метилирована, а часть - неметилирована по данному сайту), то электрофоретический анализ препарата, полученного при обработк ДНК рестриктазой Hpall, выявляет картину, которая представляет собой сочетание элек-трофоретических профилей, показанных на рис. 16.4. Таким образом, при сравнении результатов электрофореза препаратов, полученных при расщеплении ДНК рестриктазами Hpall и Mspl, можно выявить степень метилирования сайтов CCGG в данном препарате ДНК. Распределение сайтов метилирования в определенных генах можно изучить с помощью переноса и гибридизации по Саузерну электрофоретически разделенных фрагментов рестрикции с использованием в качестве радиоактивных зондов искомых клонированных генов (рис. 16.14). Метилирование тех или иных остатков может быть также выявлено при анализе нуклеотидной последовательности по методу Максама - Гилберта. Метильная группа в т5С блокирует специфическое расщепление по этому остатку, поэтому отсутствие соответствующего фрагмента в наборе, образующемся при статистическом расщеплении по С, указывает точную локализацию модифицированного основания.

СН3 I

CG

GC

Определенные сайты метилирования в ДНК соматических клеток оказываются метилированными также и в ДНК дочерних клеток. При полуконсервативной репликации последовательности Cm5CGG, в которой метилированы обе цепи, дочерние ДНК первоначально получают только по одной метилированной цепи. В эукариотических клетках присутствует так называемая поддерживающая метилаза, которая вскоре узнает возникшие при репликации «полуметилированные» сайты и метилирует остаток С в соответствующем сайте новосинтезированной цепи ДНК (рис. 16.15).

В то же время уровень метилирования ДНК в клетках данного типа подвержен изменениям. Изменения в уровне экспрессии генов данной клетки часто сопровождаются процессами метилирования и деметили-рования (рис. 16.15) определенных сайтов, расположенных в области лоПоддерживающее Метилирование

метилирование <-Н3 dg ^CG CG ^ CG-GC ^ GC ^ GCметилированный сайт

Полуметилн -рованный сзйт

Рис. 16.15. Три возможных состояния метилирования CG-сайтов в двухспиральной ДНК. Полуконсервативная репликация полностью метилированного сайта приводит к образованию полуметилированного сайта, т.е. метилированного только по остатку С родительской цепи. Поддерживающая ме-тилаз

страница 48
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.12.2019)