Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

ании анализа родословных определены группы сцепления для 70 генов человека. Картирование многих из этих генов стало возможным после того, как было показано их сцепление с другими генами, локализацию которых удалось установить методами генетики соматических клеток. Примером этого служит картирование гена резус-фактора, впервые открытого в 1939 году. В 1971 г. изучение родословных показало, что ген Rh сегрегирует сцепленно с геном РЕРС, кодирующим пептидазу С. Годом позже при изучении соматических клеток ген РЕРС был локализован в хромосоме 1. Таким образом, стала известной группа сцепления и для гена Rh, кодирующего резус-фактор. В настоящее время картировано около 500 аутосомных генов, причем 100 из них картировано за последние 12 месяцев. Подавляющее большинство этих генов локализовано методами генетики соматических клеток.

Гибридизация клеток в культуре

В I960 г. было показано, что при совместном культивировании клеток двух различных линий они могут сливаться, образуя гибриды, содержащие геномы обеих родительских форм. Первые гибридные клетки были получены при слиянии культивируемых клеток разных линий мышей. Кроме внутривидовых получены и межвидовые гибриды, например,

бласты линии SJD взяты у больного с синдромом Сэндхофа-Яцкевича. Неслившиеся клетки двух родительских линий показаны вверху, дикарион, образовавшийся после обработки вирусом Сендай,-внизу. (По Ratazzy М.С. et al, 1976. Am. J. Hum. Genet., 28, 143-154.)

Б

Рис. 18.4. Дикарион, образовавшийся при слиянии двух клеток. Родительские клетки относятся к двум линиям фибробластов: TSD и SJD. Первые взяты от больного амавро-тической идиотией (синдром Тэя— Сакса). Ядро такой клетки окрашено черным, что отражает включение радиоактивного 3Н-тимидина. Фибромежду клетками человека и мыши, мыши и хомячка и даже мыши и цыпленка.

Образование гибридных клеток происходит гораздо чаще, если в культуру добавлены некоторые вещества, например полиэтиленгли-коль или инактивированные вирусы. Для этой цели часто используют вирус Сендай. У вирусов обычно имеются один и более специфических участков, благодаря которым они могут связываться с рецепторами клетки-хозяина. На поверхности вируса Сендай таких участков несколько. Таким образом, одна вирусная частица способна образовать мостик, соединившись сразу с двумя клетками. Вследствие очень малого размера вирусной частицы клетки окажутся чрезвычайно тесно сближены. При этом может произойти слияние плазматических мембран клеток и образоваться дикарион-клетка с двумя ядрами (рис. 18.4). Затем ядра

Рис. 18.5. Получение гибридной клеточной линии человек - грызун. Человеческие клетки, в данном случае лейкоциты, смешиваются с клетками выбранной линии грызуна в присутствии вируса Сен-дай. Сначала формируются клетки с двумя ядрами, дикарионы. При слиянии ядер образуются одноядерные гибридные клетки, синкарионы. Если клетки переносятся на селективную среду, то вырастают только гибридные линии. Например, если реципиентная линия клеток грызуна несет ауксотрофность по глицину, используют селективную среду, не содержащую этой аминокислоты. Неслившие-ся лейкоциты человека также неспособны про-лиферировать в культуре клеток. Каждая выросшая колония клеток содержит полный геном реципиентной клеточной линии грызуна и несколько донорских хромосом человека.

Гибридная колония 1 Гибридная колония И

Гибридная колония III

также могут слиться с образованием синкариона, содержащего хромо» сомы обоих родителей. По непонятным причинам в течение нескольких первых делений гибридной клетки происходит быстрая потеря хромосом одного из объединяемых видов. У клеточных гибридов мышь—хомячок происходит утрата хромосом мыши. У гибридов клеток мыши и человека утрачиваются хромосомы человека. Обычно через 30 поколений гибридная клеточная линия мышь—человек содержит полный хромосомный набор мыши и только семь человеческих хромосом. Эта цифра является средней, некоторые клетки содержат только одну-две пары человеческих хромосом, тогда как другие-до 20 (рис. 18.5). Одна клеточная линия, хромосомы которой утрачиваются после слияния, называется донорной, а другая-реципиентной.

Отбор клеточных гибридов с помощью метода HAT

Потеря хромосом у гибридов между клетками мыши и человека-это случайный процесс. То, какая хромосома сохранится и стабилизируется в гибридной линии,-дело случая. Однако из всей популяции гибридных клеток можно отобрать стабильные линии, содержащие желаемые гены и хромосомы, используя селекционные методы. Эти процедуры аналогичны тем, которые используются для отбора определенных классов рекомбинантов, образующихся при скрещиваниях бактерий или дрожжей.

Отсутствие у родительской линии мышиных клеток какой-либо существенной функции, например способности синтезировать необходимый метаболит, может быть супрессировано при внесении элементов генома человека. Из такой гибридной линии могут постепенно утратиться все человеческие хромосомы, кроме той, которая содержит ген, отвечающий за незаменимую функцию. Таким образом, можно отобрать гибридные клоны, содержащие конкретные человеческие хромосомы. Такой предварительный отбор облегчает картирование генов, расположенных в этой хромосоме.

Один очень широко используемый метод отбора гибридных клеток называется НАТ-селекцией. Это название - аббревиатура английских наРис. 18.6. Отбор стабильных гибридных клеточных клонов по методу HAT. В том случае, если родительская линия клеток мыши лишена тимидин-киназной активности, на селективной среде HAT будут образовывать колонии только гибридные клетки, содержащие хромосому человека 17. В этой хромосоме расположен ген ТК человека.

Неспособность к росту

званий веществ: гипоксантина, аминоптерина и тимидина, присутствующих в селективной среде. Аминоптерин блокирует синтез пуринов и пи-римидинов. Для того чтобы синтезировать ДНК, клетки должны реутилизировать пурины и пиримидины, образующиеся при деградации полинуклеотидов. В обмене нуклеотидов принимает участие большое количество ферментов. Один из этих ферментов - тимидинкиназа (ТК), осуществляющая превращение тимидина в тимидинмонофосфат. Если в используемой мутантной линии клеток мыши отсутствует этот фермент, то на селективной среде HAT, в которой отсутствует тимидинмонофосфат, могут расти клетки, получившие хотя бы одну из гомологичных хромосом человека, содержащих ген ТК. Цитологические исследования показали, что все отбираемые клеточные линии содержат хромосому человека 17 (рис. 18.6). С помощью таких клеточных линий могут быть картированы и другие гены человека (помимо гена ТК), локализованные на семнадцатой хромосоме. Задача сводится к идентификации продуктов генов человека, которые нарабатываются в отобранных гибридных линиях.

Селективная среда HAT может быть использована для отбора клонов, содержащих и другие хромосомы. Например, фермент фосфорибо-зил-гипоксантин—трансфераза (HPRT) участвует в синтезе пуринов. Если линия клеток мыши утрачивает способность синтезировать HPRT, то этот дефект может быть возмещен присутствием соответствующего гена человека. Показано, что все гибридные клоны, отобранные по этому признаку, содержат человеческую Х-хромосому, в составе которой находится ген HPRT. Разработаны другие селективные схемы, позволяющие проводить картирование генов, локализованных и на других хромосомах, кроме X и 17.

Дополнение 18.1;. Дифференциальное окрашивание

хромосом человека ; "?>,>'

Поздние профазные и метафазные хромосомы человека после инкубирования в лимонной кислоте и окрашивания красителем Гимза покрываются темными и светлыми поперечными полосами разной ширины (G-полосы). Характер распределения этих полос различен для большинства хромосом и является строго воспроизводимым. После инкубации с акрихинипритом при освещении ультрафиолетом выявляются флуоресцирующие Q-полосы. Распределение выявляемых полос при обоих типах окраски совпадает. Это свидетельствует о том, что такое окрашивание визуализирует какие-то реально существующие структуры хромосом. На парижской конференции 1971 г. была разработана номенклатура для обозначения G-полос. Для обозначения короткого и длинного плеч хромосомы используют буквы р и q. Каждое хромосомное плечо разделяется на районы, нумеруемые по порядку от центромеры к те-ломерной области. В некоторых плечах выделяют один такой район, тогда как в других-2-4 района. Полосы внутри районов также нумеруются по порядку от центромеры. Запись 1рЗб означает, что рассматривается шестая полоса района 3 короткого плеча первой хромосомы, наиболее заметная полоса в этой хромосоме. На рисунке 18.20 изображены полосы на хромосомах человека и соответствующая нумерация. Полосы могут иногда быть разделенными на суб-по-лосы, видимые в поздней профазе. Эти

Схема хромосомы 14 на стадиях 400 (слева), 550 (в центре) и 850 (справа) полос, иллюстрирующая использование парижской но- , менклатуры для обозначения плеч хромосом, районов, полос и суб-полос, (По Yunis LL, 1981. Chromosomes and cancer: new nomenclature and future directions, Hum. Path. 12, 494 - 503.)

суб-полосы сливаются в единые полосы на метафазных хромосомах. Для обозначения этих суб-полос в номенклатурный индекс вводится точка. Нумерация суб-полос также идет от центромеры к теломере, например 1р36.1 и 1.36.2.

В том случае, если локализация гена внутри хромосомы известна, для ее обозначения используют индекс полосы. Например, локализация гена ESD, кодирующего эстеразу D, обозначается 13р14 -четвертая полоса первого района короткого плеча тринадцатой хромосомы. Локализация генов не всегда известна с точностью до полосы. Так, «адрес» гена Rbl (ретинобластома-1)-13q, что означает расположение в длинном плече тринадцатой хромосомы. Стрелка, объединяющая два участка хромосомы, используется в тех случаях, когда ген нельзя локализовать более точно. Так, расположение гена MAN А, кодирующего ос-маннозидазу-А, обозначается 15qll -*? qter. Это означает, что ген находится в длинном плече пятнадцатой хромосомы между полосой 11 и терминальным районом.

Слева направо, дифференциальная сегмент

страница 62
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(16.12.2019)