Биологический каталог




Современная генетика. Том 2

Автор Ф.Айала, Дж.Кайгер

осле трансфекции необходима цитологическая идентификация перенесенного фрагмента хромосомы в клетках, отобранных по активности исследуемых генов. В различных клеточных линиях могут находиться фрагменты разной длины.

ванных фрагментов данной хромосомы, различающихся по величине, можно определить синтению и порядок генов. Естественно, это возможно тогда, когда гены, отсутствующие в малых фрагментах, выявляются при встраивании фрагментов большего размера (рис. 18.15).

Кроме такого прямого подхода, порядок генов и их относительное сцепление можно изучать по частотам котрансформации этих генов. Такие эксперименты сводятся к измерению частот совместного встраивания в геном одной клетки двух разных генов. Гены, кодирующие галак-токиназу (GALK), растворимую тимидинкиназу (ТК1), и проколлаген 1 (COLM), расположены в длинном плече хромосомы 17 (рис. 18.16). При исследовании линий, трансформированных по маркеру ТК1, определено, что частота котрансформации для GALK равна 19% (5 из 27 трансформантов). Для COLM частота котрансформации с ТК1 равна 74% (20 из 27). Отсюда следует, что ген ТК1 расположен на хромосоме 17 ближе к гену COLM, чем к GALK. Расстояния между генами могут быть рассчитаны в единицах переноса генов, опосредованного хромосо, COLM ч

GALK / TK 1 \ч

'W'i i ^s^A

| 26 единиц 1—26 единиц 1

I 81 единица 1

Рис. 18.16. Карта сегмента хромосомы 17 человека, построенная по результатам переноса генов в составе транслоцированных фрагментов хромосомы. (По Klobutcher Z. A., Ruddle Е.Н., 1981. Annu. Rev. Biochem., 50, 533-534.) Дополнительные данные указывают на то, что локус COLM находится вне фрагмента GALK—ТК1.

мами (ПГОХ). Расстояние в одну единицу соответствует частоте котрансформации в 99%. Тогда в этих единицах расстояние между генами ТК1 и COLM равно 100 - 74 = 26, а между ТК1 и GALK-100-19-81. Сами по себе эти цифры ничего не говорят о взаимном расположении исследуемых генов, но данные о том, что ТК1 иногда котрансформи-руется с GALK, не захватывая COLM, указывают на то, что порядок этих генов следующий: GALK-TK1 -COLM.

Картирование генов

с помощью ДНК-зондов

Методы картирования генов, обсуждавшиеся в предыдущих разделах, были основаны на экспрессии изучаемых генов в культурах клеток. Гены, кодирующие ферменты клеточного метаболизма, (табл. 18.2) и гены, кодирующие поверхностные антигены, такие, как белки главного комплекса гистосовместимости или антигены группы крови, удовлетворяют этому условию. Гены, не обладающие подобным фенотипиче-ским проявлением, не могут быть картированы лишь с использованием описанных методов. Это ограничение удается преодолеть с помощью методов генной инженерии. При этом становится возможным картирование любых последовательностей ДНК, для которых можно получить соответствующий ДНК-зонд. Эти методы внесли поистине революционный переворот в генетический анализ гибридов соматических клеток.

Первое применение методов работы с рекомбинантными ДНК для картирования генов человека включало ДНК-гибридизацию в растворе, Таким образом, удалось картировать гены а- и ГЗ-глобинов. Зонды, представляющие собой комплементарные ДНК (кДНК) этих генов, были получены с помощью обратной транскрипции очищенных а- и fj-гло-биновых мРНК. Эти зонды в определенных условиях не взаимодействуют друг с другом или с глобиновыми генами мыши, но образуют стабильные дуплексы при отжиге с соответствующими последовательностями ДНК человека. Глобиновые кДНК-зонды использовали для тестирования в растворе препаратов ДНК, выделенных из различных гибридных клонов. Образование стабильного дуплекса между кДНК-зондом и ДНК исследуемого препарата свидетельствовало о присутствии человеческих глобиновых генов в геноме соответствующей гибридной линии. Кариологический анализ выявленных таким образом гибридных клонов позволил заключить, что гены р-глобинового семейства расположены в хромосоме 11, а а-глобиновые гены-в хромосоме 16.

Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК. Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как 32Р или 3Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК. Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК

Таблица 18.2. Ферментные маркеры, используемые для определения групп сцепления генов человека при работах с культурами клеток

Хромосома Плечо Фермент (символ гена)

1 р Енолаза l(EN01)

р Фосфоглюкомутаза-1 (PGM1)

q Пептидаза-С (PEPС)

q Фумаратгидратаза (FH)

2 р Малатдегидрогеназа-1 (MDH1)

q Изоцитратдегидрогеназа-1 (IDH1)

3 р Аминоацилаза-1 (АСУ!)

4 ? Пептидаза (PEPS)

р? Фосфоглюкомутаза-2 (PGM2)

5 q ГЗ-гексозаминидаза-В (НЕХВ)

6 р Глиоксалаза 1 (GLO)

q Супероксиддисмутаза-2 (S0D2)

q Малатдегидрогеназа-1 (МЕ1)

7 q ГЗ-глюкуронидаза (GUSB)

8 р Глутатионредуктаза (GSR)

9 р Аконитаза-1 (АС01)

q Аденилаткиназа-1 (АК1)

10 q Глутамат-оксалоацетат—трансаминаза-1 (GOT1)

11 р Лактатдегидрогеназа-А (LDHA)

12 р Триозофосфатизомераза-1 (TRI1) q Пептидаза-В (РЕРВ)

13 q Эстераза-D (ESD)

14 q Нуклеотидфосфорилаза (NP)

15 q Маннозофосфатизомераза (МР1) q Пируваткиназа-М2 (РКМ2)

16 q Аденозинфосфорибозилтрансфераза (APR Т)

17 q Галактокиназа (GALK)

18 q Пептидаза-А (PEPА)

19 ? Глюкозофосфат-изомераза (GPI) ? Пептидаза (PEPD)

20 q Аденозиндезаминаза (ADA)

21 q Супероксиддисмутаза (SOD1)

22 q Аконитаза-2 (ЛС02)

X q Глюкозо-фосфатдегидрогеназа (GGPD)

q Фосфоглицерокиназа (PGK)

По S/ious ТВ. (1982). Adv. Human Genetics, 12, 341-452.

обрабатывают рестрицирующими эндонуклеазами, а полученные фрагменты ДНК разделяют гель-электрофорезом, денатурируют и переносят на нитроцеллюлозные мембранные фильтры. На фильтрах осуществляется гибридизация с тем или иным меченым ДНК-зондом. Для большей эффективности можно разделять амплифицированные фрагменты хромосомной ДНК. Для этого используют их предварительное клонирование на фаговых векторах.

После гибридизации фильтры накладывают на рентгеновскую пленку, на которой после проявления обнаруживаются полосы, соответРис. 18.17. Картирование клонированных генов человека при использовании гибридов соматических клеток мыши и человека с помощью блот-гибриди-зации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, служащие маркерами данных хромосом, выявляются с помощью гель-электрофореза. Ре-стрикционные фрагменты ДНК, выделенной из гибридной линии, разделяют электрофорезом в агароз-ном геле и переносят на нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зондом, меченным радиоактивными изотопами. (По Shows Т. В. et al, 1982. Adv. Hum. Genet., 12, 341-452.)

Клои гибридных клеток человек - мышь

Клетки для кариотипирования

Хромосомный набор гибридных клеток

Перенос фрагментов на нитроцеллюлозный фильтр, гибридизация с зондом, меченным 32 Р

Радиоавтография фильтра, проявление пленки для выявления гибридизующихся зон

Корреляция между присутствием ферментного маркера, определенной хромосомы ^_ и определенной полосы при гибридизации позволяет соотнести исследуемый ген с той или иной хромосомой человека

ДНК

Расщепление рестриктазами

Разделение фрагментов эле ктрофорезом в агарозном геле

12 3 4 5 6

7 8 9 10 II 12 13

ствующие рестрикционным фрагментам, содержащим последовательности ДНК, гомологичные данному зонду (рис. 18.18). Гены соотносят с определенными хромосомами человека на основании корреляции между присутствием данной хромосомы в гибридной клеточной линии и наличием гибридизующегося фрагмента человеческой ДНК на ра-диоавтограмме. Данный метод более чуствителен, чем гибридизация ДНК в растворе и, главное, более специфичен.

Результаты эксперимента по картированию гена химотрипсиногена В (CTRB) приведены в таблице 18.3. «Плюсы» и «минусы» во втором столбце таблицы отражают результаты гибридизации по Саузерну. Следующие столбцы таблицы указывают на присутствие тех или иных хромосом человека в гибридных линиях. Единственная хромосома, которая имеется во всех гибридных клеточных линиях, дающих положительный ответ в блот-гибридизации, и отсутствует в линиях, дающих отрицательный ответ,-это хромосома 16.

Метод гибридизации по Саузерну, соединенный с подходами, разработанными для генетического анализа соматических клеток, с успехом применялся не только для картирования определенных генов (табл. 18.4), но и для локализации последовательностей ДНК с неизвестными функциями, найденными в библиотеках генов человека.

1. TSL-2

2. ICL-15

3. XER-11

4. XER-7

5. EXR-3

6. XER-9

7. EXR-9

8. MAR-2

9. DUA-5 BSAgA

10. XTR-22

11. REX-12

12. ALR-1BSH6 - + +

+ + + + + +

+ + + + + +

+ + + + + + + + ++ +---- + - + + - +--- + -- + + --- + + + + + + + ++ + + -- + + -- - +

+ + + + + +

+ + + -- - + + + + + + +

+ + + + + + + + +

+ + + + Гибридизация in situ

Вышеописанная процедура определения хромосомной локализации генов включает в себя два основных этапа. Первый этап заключается в цитогенетической идентификации хромосом или фрагментов хромосом, присутствующих в гибридной линии клеток. На втором этапе с помощью гибридизации ДНК, в растворе или по методу Саузерна устанавливают наличие искомых последовательностей. Более прямой

L-T -г

у

Я ^ Lji u ti

5 - | Ё s i"

R S -i л " S ?

П г S В й я В

8 9 10 11 12 13 14 15

I I

^™ ^™ ИиаХ

' < М .» . *.„^ НН

17 18 19 20 21 22

способ картирования генов заключается в непосредственной гибридизации между радиоактивными зондами и метафазными хромосомами. Этот метод гибридизации in situ был ра

страница 64
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75

Скачать книгу "Современная генетика. Том 2" (5.25Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.09.2019)