NPS1 ABO LABL

SI 4 SOD1 IFRC PRGS

THC

AABT

LDLR

BAS

HTOR

CBS

P '

q i

10

22

PKU1

OMR

PFKF

GSAS

Ml 30

PP

HK1

LIP A GOT1

ADK

DHFR FUSL

SHCP2 HA GH

got:

PGP

CGTr—THBZ (2 loci) О AG-! HBAj2loci) r

APRT LHBHR

CTRB .

"hp 1"

LCAT 0IA4

TK2 CTH LIP В Gel'2 ESB3 GPT1 LBS I A VR D1PI

RNR

CES DGS

IGLH w?#)

GLB2 LcA(>6)

CML ARSA DIA1 AC02 NAGA IDA SI i SIS

ЈCAT

WAGR

I-INS.IRDNRWS

HBE

HBG2

HBG1

HBGR

HBD

HBB

HPA1 *

AN2 HRAS1 MA ЗОЛ SI. 3+4 LDHA . , . ATN

{ZSfcp pth

ACP2

FS

IK

ME2 GANAB S2

ESA4 PBGD

НУ IS BVIX MIC4

M4F2 FN

LEU 7 GST1

T- MULi>

jM5l

—I M

Ell

SOP 75 GLAU1

MDLS4MYHSi^-^

М/С* i-MYHSK GALK

GHPL

C0L1A1 TK1 LA12M4

•-GAA ERBA

сквв

HYA (TDF)

STA

Трансфекция и наследственные болезни

Методы переноса генов потенциально приложимы к лечению наследственных аномалий человека. Например, ген, кодирующий нормальный гемоглобин, мог бы быть передан человеку, страдающему серповидно-клеточной анемией, болезнью, вызванной присутствием аномальной р-глобиновой цепи. Если нормальный Р-глобиновый ген будет введен в стволовые клетки, которые дают начало эритроцитам, то последние смогут синтезировать нормальный гемоглобин. Таким образом, индивидуум будет «вылечен». Устранение генетических дефектов генома с помощью трансфекции нормальными генами представляется делом отдаленного будущего. Одна из основных трудностей-это низкая эффективность трансфекции. Даже в наиболее удачных случаях доля трансформированных клеток очень мала. Более того, пока трансфекция проводится с культурами клеток, а не с целыми тканями живых организмов, что потребуется для исправления генетических дефектов.

Онкогены

Трансформация культур клеток с помощью ДНК недавно привела к открытию генов, участвующих в канцерогенезе. Эти гены называют онкогенами. Некоторые формы раковых заболеваний имеют явно выраженную генетическую природу. Характер наследования указывает на то, что заболевание может определяться одним геном. В качестве примера подобного заболевания можно привести ретинобластому, наследуемую по доминантному типу. Это заболевание проявляется в детстве как раковое поражение одного или двух глаз, которое быстро переходит на мозг, что при отсутствии лечения приводит к ранней смерти больного. Хотя известны многие виды раковых заболеваний, наследование которых подчиняется законам менделевского расщепления признаков, все они достаточно редки и охватывают лишь незначительную долю людей больных раком. Более распространенные формы рака не имеют такой четко выясненной генетической природы, хотя предрасположенность к ним, вероятно, наследуется.

На клеточном уровне рак, однако, является определенно генетическим заболеванием. Раковая клетка передает свои неопластические свойства дочерним клеткам. Этим можно объяснить высокую пролифе-ративную активность раковых тканей. Таким образом, превращение нормальной клетки в раковую связано с какими-то генетическими изменениями. Это подтверждается экспериментами, в которых раковые клетки передавали свои свойства нормальным клеткам в культуре при трансформации последних хромосомной ДНК из раковых клеток (рис. 18.21). Другим подтверждением генетической природы рака более общего порядка служит тот факт, что онкогенные вирусы, вызывающие рак, при превращении клетки в раковую оказываются встроенными в ее геном. Такое превращение клетки или ткани называется раковой трансформацией. Этот термин не следует путать с термином «генетическая трансформация», которая обозначает включение ДНК в геном после попадания свободной ДНК в клетку.

Ретровирусы, вызывающие раковую трансформацию, это РНК-со-держащие вирусы. С помощью фермента ревертазы они способны синтезировать ДНК-копии в ходе так называемой обратной транскрипции. Эти ДНК-копии способны встроиться в геном клетки. Интегрированная копия называется провирусом. Некоторые ретровирусы, известные как активно трансформирующие вирусы, высоко онкогенны. Они вызывают неопластические заболевания у зараженных ими животных. В культуре клеток эти вирусы вызывают трансформацию клеток, протекающую с высокой эффективностью. Около 20 таких вирусов было выделено из крыс, мышей, обезьян, кошек, цыплят и индюков (например, вирусы саркомы Харвея и саркомы Малони выделены из крыс и мышей соответственно). Кроме генетической информации, необходимой для своей собственной репликации, эти вирусы несут специфические гены, называемые онкогенами, ответственными за их способность вызывать раковую трансформацию. Сейчас известно около 15 генов one, включая ген sre вируса саркомы Рауса, поражающего кур, ген mos вируса саркомы мышей и ген ras вируса саркомы крыс.

Недавние исследования показали, что онкогены гомологичны по некоторым последовательностям ДНК нормальных клеток млекопитающих, не инфицированных ретровирусами. Это открытие лежит в основе

Рис. 18.21. Клетки, трансформированные ДНК из раковых клеток. Нормальные клетки мыши обрабатывали ДНК, выделенной из опухоли. Через две недели образовывался плотный очаг трансформированных клеток, видимый слева. Справа клетки остались не-трансформиро ванными. (Courtesy of Chiacho Shih, R. A. Weinberg, Massachusetts Institute of Technology.)

*4

двух важных гипотез, относящихся к возникновению рака на клеточном уровне. По одной из этих гипотез онкогены произошли от гомологичных генов, присутствующих в нормальных клетках. В рамках другой гипотезы раковая трансформация является следствием аномальной экспрессии нормального гена. Последняя может наблюдаться не только в случае трансформации, вызванной вирусами, но и при других формах рака.

Дополнительным подтверждением гомологии между онкогенами и последовательностями нормальных клеток служит и тот факт, что они, как правило, кодируют аналогичные белки. Например, онкоген вируса саркомы Рауса кодирует тирозин-специфичную киназу, обозначаемую pp60src. Этот белок представляет собой фосфопротеин молекулярной массы 60000. Такой же белок выделяется и из нормальных клеток цыпленка, хотя в этих клетках его количество в 100 раз меньше, чем в раковых. Использование клонированных фрагментов онкогенов в экспериментах по ДНК-гибридизации выявило гомологию между геном rasH вируса саркомы Харви и геном из клеток карциномы мочевого

пузыря человека. Аналогичные результаты получены для гена rasK вируса саркомы Кирштейна и соответствующего гена из клеток карциномы легкого. Сейчас считается общепризнанным, что онкогены произошли в результате встраивания мРНК некоторых клеточных генов в геном ретровирусов.

Трансфекция генов и рак

ДНК из клеток карцином мочевого пузыря и легкого (вызываемых генами, гомологичными вирусным онкогенам ras) способна сама по себе индуцировать неопластическую трансформацию в культуре клеток мыши. Наиболее часто в подобных экспериментах используется реципиент-ная линия клеток мыши, обозначаемая NIH3T3. При трансформации с помощью ДНК, выделенной из неопластических клеток, клетки NIH3T3 становятся раковыми с частотой 0,05-1 трансформантов на 1 мкг ДНК. Эту трансформацию вызывают препараты ДНК, выделенные лишь примерно из 50% опухолей, включая как спонтанные, так и индуцированные опухоли различных организмов (таблица 18.10).

Еще более важным обстоятельством представляется то, что неопластическая трансформация происходит и при трансфекции клеток линии NIH3T3 с помощью ДНК из нормальных клеток. Причиной этого явления может быть аномальная экспрессия нормальных генов. Трансформирующая способность ДНК из нормальных клеток может быть показана в экспериментах двух типов. Во-первых, при использовании для трансформации последовательностей ДНК из нормальных клеток, гомологичных вирусным онкогенам ras и mos, которые способны индуцировать неопластическую трансформацию. Во-вторых, при трансфекции тотальной геномной ДНК, выделенной из различных нормальных клеток животных.

Из нормальных клеток мыши был выделен ген, гомологичный онкогену mos. Этот ген не обладал трансформирующей активностью в тех случаях, когда он был фланкирован последовательностями ДНК из нормальных клеток. Однако после соединения этого гена с вирусными последовательностями, обеспечивающими эффективную транскрипцию, была получена структура, обладающая трансформирующей активностью, не отличающейся от активности онкогена mos. Подобные результаты получены для гена, гомологичного ras, выделенного из нормальных клеток крысы. Далее было показано, что при удалении 5'-последовательности, фланкирующей ген мыши, гомологичный mos, этот ген приобретает трансформирующую активность. В этом случае трансформирующая активность оказывается в 1000 раз ниже, чем при трансформации тем же геном, но соединенным с регуляторными элементами вируса. Эта низкая, но все же достоверная трансформирующая активность, вероятно, объясняется встраиванием донорного гена под контроль некоего активного клеточного промотора. Эффективная экспрессия встроенного гена приводит к раковой трансформации клетки.

Более общее подтверждение присутствия потенциальных онкогенов в нормальных клетках были получено в опытах по трансформации ДНК, выделенной из нормальных клеток цыпленка, мыши и человека. Препараты ДНК со средним размером выше 30 т.п.н. неспособны вызывать трансформацию. При фрагментировании той же ДНК до размеров от 0,5 до 5 т.п.н. эффективность трансформации достигает уровня 0,003 трансформированных клеток на 1 мкг ДНК.

Эта эффективность на два порядка меньше, чем в случае трансформации ДНК из раковых клеток. Но когда для трансформации используют ДНК, выделенную из клеток, трансформированных «нормальной» ДНК, то эта вторичная трансформация позволяет получать уже от 0,1 до 1 трансформанта на 1 мкг ДНК. Данная величина не отличается от тех значений частоты трансформации, которую можно получить при работе с ДНК, выделенной из спонтанных или химически индуцированных опухолевых клеток. Эти результаты позволяют предположить, что потенциальные онкогены нормальных клеток активируются при перестройках ДНК, сопровождающих трансформацию. Фрагментирова-ние ДНК норм