нных 2-аминопурином. Последовательность оснований в кодо-нах, выписанных под каждой аминокислотой, установлена по наблюдавшимся заменам; Ру означает пиримидин (урацил или цитозин).

вение реверсий под действием азотистой кислоты также используется для доказательства транзиционной природы прямых мутаций (рис. 20.6).

Поскольку 2-аминопурин, 5-бромурацил и азотистая кислота индуцируют как прямые, так и обратные мутации, с помощью этих мутагенов нельзя получить лишь транзиции GC -»? AT или AT -* GC. Гидроксил-амин, напротив, воздействует только на цитозин, переводя его в форму, способную к спариванию с аденином (рис. 20.7). Это приводит к направленным мутациям GC-*AT. Гидроксиламин не способен индуцировать обратные мутации, однако такие мутации могут индуцироваться мутагенами, действующими в обоих направлениях. Описанный механизм действия 2-аминопурина подтверждает анализ аминокислотных замен белка триптофансинтетаза А Е. coli, вызываемых 2-АП-индуцированными реверсиями специфических мутаций (рис. 20.8).

Механизмы возникновения трансверсий менее понятны. Трансверсии можно идентифицировать по отсутствию реверсий под действием мутагенов-аналогов нормальных нуклеотидных оснований. Известно, что именно трансверсиями являются многие мутации, индуцируемые уль

трафиолетовым облучением. Возможно, причина их возникновения заключена в механизме репарации, который мы вкратце обсудим в дальнейшем.

Мутации, вызывающие сдвиг рамки считывания

В главе 12 мы уже рассматривали мутации этого типа и сравнивали их с заменами оснований. Мутации со сдвигом рамки составляют значительную долю всех спонтанных мутаций. Спонтанные г//-мутации фага Т4, вызывающие сдвиг рамки считывания, происходят во время репликации ДНК в клетке хозяина, но не при накоплении частиц фага. Большинство мутаций, происходящих в этот период, представляют собой транзиции (что следует из их способности к индуцированным реверсиям), которые могут происходить в результате спонтанного дезамини-рования цитозина.

Данные о природе мутаций со сдвигом рамки получены при анализе аминокислотной последовательности белков, которые кодируются генами, содержащими взаимно супрессирующие мутации рамки (см. гл. 12). На рис. 20.9 сравнивается аминокислотная последовательность лизоци-ма фага Т4 дикого типа с соответствующими последовательностями белков фаговых мутантов, несущих две мутации со сдвигом рамки. С помощью таблиц генетического кода мы можем восстановить вероятные нуклеотидные последовательности как дикого типа, так и му-тантной мРНК. Оказывается, что они отличаются друг от друга вставкой и делецией одного или нескольких нуклеотидов. На рис. 20.9А представлен пример обсуждавшегося ранее типа взаимной супрессии. Делеция одного остатка аденина в сериновом кодоне м-РНК дикого типа сдвигает рамку считывания в одном направлении, а вставка одного гуанина перед кодоном аланина сдвигает рамку в противоположном направлении. Соответственно в белке двойного мутанта оказывается измененной последовательность пяти аминокислот. Рис. 20.9J5 иллюстрирует эффект сочетания вставки двух нуклеотидов GU (вслед за уже упоминавшимся кодоном серина) со вставкой G перед кодоном аланина. Результат состоит в сдвиге рамки на целый кодон, что приводит к появлению одной дополнительной аминокислоты в белке и замене последовательности из четырех аминокислот в белке дикого типа новой последовательностью из пяти аминокислот в белке двойного мутанта. На рис. 20.9В изображен случай, когда двойной мутант возник в результате комбинации двухнуклеотидной вставки и двухнуклеотидной деле-ции. Эти примеры показывают, что единичная мутация со сдвигом рамки может быть скорее результатом вставки двух соседних нуклеотидов, чем одного, как это предполагалось в гл. 12. Некоторые единичные мутации являются следствием одновременных изменений до пяти соседних нуклеотидов.

5' АС . AAAAGTCC А

А з'1 I I I I I I I I I I I I I I ! | | | М | | | М М

TGTTTTCAGGT

5' АС . AAAAGTCC А

yl I I I I N I I I 1 I I М 1 I I I I I | | I !! | !

TG* ТТ TTCA^GGT

В

Разрыв

5'. AC. AAAAGTCC А

3'1 М I I I I I I М I М I III I I I I

Т ТТСА GGT

G Т Л

• Т Неправильное спаривание

5' AC .AAAAGTCCA

Г ,,111111111 II I 1 ! I I | I И I I I 1«— Репликационная

"*Т TTCACAGGT вилка

Т Т < Новый синтез и восстановление

' Т двойной спирали

Рис. 20.11. Несколько модифициро- раль белок вызывает расхождение

ванная модель мутации сдвига рам- цепей и их неправильное воссоединеки Стрейзингера. А. Исходная моле- ние. Г. Репаративный синтез заполкула ДНК. Б. Возникновение разры- няет брешь, возникшую на стадии В.

ва. В. Раскручивающий двойную спиБолылая часть изученных мутаций, вызывающих сдвиг рамки, обнаружена в последовательностях, которые состоят из одинаковых оснований или пар оснований (рис. 20.10). Джордж Стрейзингер предложил гипотезу возникновения мутаций со сдвигом рамки, в соответствии с которой они происходят в результате локальной диссоциации двойной спирали и последующего неправильного ее восстановления в участках, содержащих одинаковые основания (рис. 20.11). В соотвествии с этой гипотезой действие мутагенов, сдвигающих рамки считывания, должно состоять в облегчении образования таких неправильно реассоцииро-ванных участков или в их стабилизации.

Мутагенез и репарация

Прокариотические и эукариотические клетки реагируют на повреждение ДНК синтезом множества различных ферментов, которые обеспечивают жизнеспособность клетки и устраняют повреждения ДНК. Этот ответ, называемый SOS-репарацией, наиболее тщательно исследовали у Е. coli, у которой, как известно, поврежденная ДНК активирует про-теазу Rec А, а та в свою очередь инактивирует репрессор Lex А путем протеолиза (см. гл. 14). Инактивация этого репрессора приводит к индукции множества различных генов, участвующих в SOS-репарации.

Удивительным следствием включения системы SOS оказывается значительное увеличение частоты мутаций, несмотря на то что ДНК и так уже повреждена. Лучше всего это можно показать, инфицируя облученные и не облученные ультрафиолетом клетки Е. coli частицами фага, не подвергавшимися действию ультрафиолетового излучения. Частота мутаций у потомства фагов, инфицировавших облученные клетки, по

Облучение бактерий

Уф

О

Уф

о

JAG "Get ст ч*/ Ч' V

TAG ч* Ч* V

TAG

CAG "GCT "СТ

?еа Уф

о

CAG

5СТ СТ

Ч* Ч/ V

TAG

.ш

CAG GCT СТ

ч/ Ч/ V

TAG

ш. ш.. п

шл §п р

CAG GCT СТ Т G А

CAG GCT СТ

Ч/ Ч/ V

TAG м

AG

TAG GCT СТ

Ч* Ч' V

Т A g

М13 ят7#5

Т- TAT-TAG -GCG

1137 1146

tyr amb

М13 ат6Н\

TT-GTT-TAG-GG

3061 3070

val amb

Рис. 20.12. Сравнение спонтанных и индуцированных ультрафиолетовым облучением мутационных изменений путем анализа нуклео-тидной последовательности ревертантов двух amfcer-мутантов фага М13. Две мутантные последовательности изображены в нижней части рисунка. В опытах использовали фаги, облученные или ультрафиолетом или гамма-лучами или не подвергавшиеся облучению. Этими фагами инфицировали облученные или необлученные бактерии. На рисунке изображены спектры замен оснований, приводившие к реверсии. Обратите внимание на то, что спектры спонтанных замен и замен, индуцированных ультрафиолетом, в трех положениях amber-кодона различны. Белыми квадратиками изображены транзиции, цветными - трансверсии. Обратите внимание на две тандемные замены: ТТ-+СС и AG-* -?ТС. (По A. Brandenburger et al. Nature, 294, 180, 1981. Reprinted by permission. Copyright © 1981-Macmillan Journals Limited.)

крайней мере на порядок выше, чем у инфицировавших необлученные клетки. В процессе SOS-репарации происходят как транзиции, так и трансверсии, и иногда смежные основания мутируют одновременно (рис. 20.12). У клеток, проявляющих SOS-ответ, была отмечена активность ДНК-полимеразы, вызывающая дополнительные мутации, и идентифицирован по меньшей мере один ген, а именно ити С, продукт которого необходим для индуцируемого системой SOS мутагенеза. Штаммы с инактивированным геном итиС не проявляют УФ-индуциро-ванного мутагенеза, а их чувствительность к летальному действию ультрафиолета лишь несколько возрастает.

Селективное преимущество индуцируемых систем репарации повреждений ДНК очевидно, однако роль индуцируемой системы мутагенеза не столь ясна. Возможно, что некоторые типы повреждения ДНК могут устраняться, только если пожертвовать неизменностью последовательности оснований ради сохранения неповрежденным фосфодиэфирного скелета ДНК. С другой стороны, не исключено, что подвергнутая сильному воздействию бактериальная популяция теряет сравнительно немного вследствие увеличения частоты мутаций, однако возникающие при этом некоторые новые мутации могут оказаться полезными в изменившихся условиях.

Частота мутаций

Мутации происходят редко. Так, например, вероятность того, что данная клетка Е. coli мутирует от Tls (чувствительность к фагу Т1) к типу T1R (устойчивость к фагу Т1), очень мала. Когда вероятность каждого отдельно взятого события очень мала, а число испытаний, в которых может возникнуть событие, очень велико, то частота событий подчиняется распределению Пуассона (см. приложение II.IV).

Пуассоновское распределение можно использовать для оценки частоты мутаций за поколение (т) от Tls к T1R. Для этого Сальвадор Лу-риа и Макс Дельбрюк приготовили 20 образцов бактериальной культуры, каждый из которых содержал в 0,2 мл питательной среды клетки Е. coli типа Tls в концентрации 103/мл, образцы инкубировали до тех пор, пока титр клеток не достигал примерно 109/мл. Для этого потребовалось около 20 генераций. В девяти из двадцати опытных культур было обнаружено различное количество клеток T1R, в одиннадцати культурах клеток T1R не было. Нулевой член пуассоновского распределения имеет вид

P0-e-mN,

где N число клеток в культуре (в данном случае 0,2 • 109 = 2 • 108) определяет вероятность того, что культура не содержит мутантных клеток. Логарифмируя, получаем

In р0 = — mJV, т = — In Po/N.

Поскольку 11 культур не содержа