ы и расчета квантового состава постсинаптических потенциалов. Классическими объектами для таких исследований стали нервно-мышечный синапс и симпатический ганглий. Структуры центральной нервной системы, где на теле или дендрите одного нейрона конвергируют много взаимодействующих синапсов, непригодны для таких оценок. Ритмическое раздражение двигательного нерва скелетной мышцы млекопитающего сопровождается быстрым снижением количества освобождаемого в ответ на каждый импульс медиатора, вплоть до некоторого относительно постоянного уровня. Это явление, называемое депрессией, показывает, что запас медиатора, способного к освобождению, ограничен и пополняется медленнее, чем расходуется. Депо АХ в нервно-мышечном синапсе оценивают примерной цифрой 2105 квантов. Быстрая депрессия потенциалов концевой пластинки отражает расходование небольшой части депо АХ — так называемой фракции доступного медиатора, которая составляет примерно 103 квантов для нервно-мышечного синапса лягушки.

Интересной особенностью метаболизма пресинаптических окончаний является предпочтительная секреция вновь синтезированного в цитоплазме медиатора. После инкубации нерв-

211

но-мышечного препарата или симпатического ганглия в среде с меченым предшественником АХ[3Н]-холином ритмическое раздражение нерва приводило к секреции [3Н]-АХ. Очевидно, существует фракция расположенных у активных зон синапти-ческих пузырьков, которые после экзоцитоза их содержимого сразу же подвергаются рециклизации, заполняются только что синтезированным в цитоплазме медиатором и вновь готовы к экзоцитозу.

Следует отметить, что наряду с зависимой от ионов Са квантовой секрецией медиатора, которая обеспечивает передачу сигнала через синапс к постсинаптической клетке, а также происходит спонтанно, в отсутствие нервных импульсов, существует постоянная неквантовая утечка молекул медиатора из нервного окончания. В нервно-мышечном синапсе лягушки и млекопитающих неквантовая утечка создает концентрацию АХ в синаптической щели порядка 10~8-10~7М. Общее количество АХ, секретируемого неквантовым способом, превышает выход АХ, обусловленный спонтанной квантовой секрецией. Предполагается, что неквантовая секреция медиатора играет трофическую роль.

Нервно-мышечный синапс является экспериментальным объектом, удобным для исследования электрофизиологическими методами. Однако изоляция нервных окончаний и синаптиче-ских пузырьков для биохимического исследования крайне затруднена вследствие того, что двигательные нервные окончания составляют слишком малую долю от объема ткани скелетной мышцы. Гораздо более адекватным препаратом для изучения экзоцитоза нейромедиаторов являются синаптосомы — пре-синоптические окончания, выделяемые из нервной ткани, как правило, вместе с веществом, заполняющим синоптическую щель, и участком постсинаптической мембраны. Деполяризация синап-тосом физиологическим раствором с высокой концентрацией К+ вызывает зависимую от Са2"^ секрецию нейромедиаторов.

7.2. ЭКЗОЦИТОЗ НЕЙРОМЕДИАТОРОВ

В нейрохимическом плане лучше других синапсов изучен электромоторный синапс электрического органа рыб, где нейро-медиатором служит АХ. В начале 70-х годов в лаборатории В.Уит-такера в ФРГ впервые удалось выделить изолированную фракцию синаптических пузырьков из электрического органа ската Torpedo marmorata. Именно на этом объекте с помощью биохимических, иммуноцитохимических методов и ядерного магнит-

212

ного резонанса получены фундаментальные сведения о структуре и функциях синаптических пузырьков и разработана схема их жизненного цикла (рис 7.1).

i

Рис. 7. /. Схема жизненного цикла синаптических пузырьков: СП0 — пустые пузырьки, СП] — заполненные (зрелые) пузырьки, СП2 —частично заполненные пузырьки

В аппарате Гольджи сомы нейрона формируются мембранные образования в виде пузырьков, не заполненных медиатором (фракция СП0). Эти пузырьки направляются в пресинап-тическое окончание с помощью системы быстрого аксонного транспорта. В пресинаптическом окончании пузырьки заполняются медиаторами (АХ и АТФ) посредством АТФ-зависимо-го протонного насоса. Молекулы протонной АТФазы входят в состав мембраны синаптических пузырьков и поддерживают определенный уровень мембранного потенциала. Мембрана

213

синаптического пузырька содержит также стимулируемую каль-модулином Са2+-АТФазу, которая обеспечивает поглощение пузырьками ионов Са. Популяция зрелых (заполненных) пузырьков (фракция СП{) подвергается экзоцитозу, освобождая содержимое в синаптическую щель. После этого происходит восстановление мембранной структуры синаптических пузырьков путем эндоцитоза с последующим вторичным заполнением нейромедиаторами (фракция СП2). Циклы экзоцитоз — эндо-цитоз повторяются.

¦ Эта схема согласуется с электрофизиологическими данными о квантовом характере секреции нейромедиатора и о численности квантов разных размеров в одном и том же пресинап-тическом окончании, а также с радиохимическими сведениями о предпочтительном освобождении вновь синтезированного медиатора. Таким образом, пресинаптическое окончание можно рассматривать как систему, в определенной мере автономную по отношению к телу нейрона.

Синаптические пузырьки диаметром 50-60 нм, так называемые малые прозрачные синаптические пузырьки (в отличие от другой популяции — больших электронно-плотных пузырьков), аналогичные холинергическим синаптическим пузырькам из электрического организма ската, выделены из разных отделов нервной системы представителей практически всех таксономических групп животных. Эти пузырьки отличаются низкой электронной плотностью содержимого. Они заполнены низкомолекулярными нейромедиаторами (АХ, катехоламины, глутамат, ГАМК, глицин) в отличие от больших электронно-плотных пузырьков, заполненных медиаторами пептидной природы.

Ключевую проблему в изучении экзоцитоза нейромедиаторов представляет вопрос о механизмах сближения синоптического пузырька с активной зоной пресинаптической мембраны и взаимодействия мембраны пузырька с активной зоной. Имеются данные о том, что эти процессы зависят.от Са2+ —универсального внутриклеточного посредника, участие которого в секреторных процессах может быть обусловлено активацией актомиозино-вых филаментов цитоскелета, мембранной фосфолипазы А2, аде-нилатциклазы, Са2+/кальмодулин-зависимых протеинкиназ и ряда других Са2+-связывающих белков.

Известно, что связывание Са2+ с кальмодулином индуцирует фосфорилирование ряда белков синаптосом. Ингибиторы кальмодулина и кальмодулинкиназы блокируют освобождение нейромедиаторов, вызываемое деполяризацией синаптосом. При воздействии различных факторов, влияющих на количество ос-

214

вобождаемого медиатора (деполяризация синаптосом, сдвиги концентрации Са2+ и Mg2+ в среде) и на фосфорилирование белков (ингибиторы кальмодулинкиназы диазепам и фенитоин, ингибитор кадьмодулина трифторперазин), выявлена корреляция между изменениями секреции нейромедиаторов и фосфо-рилированием белков синаптосом.

Независимо от того, из какого отдела нервной системы они получены и какой нейромедиатор содержат, малые синаптиче-ские пузырьки характеризуются специфическим набором интегральных мембранных белков, к которым относятся синапсины — фосфопротеины, фосфорилируемые цАМФ- и Са2+-зависи-мыми протеинкиназами, синаптофизин — гликопротеин, пронизывающий мембрану; синаптобревин — негликозилирован-ный белок, находящийся на цитоплазматической поверхности пузырьков; белок SNAP-25; синтаксин, синаптогамин, синап-топорин и др.

Особая роль в сближении синаптического пузырька с активной зоной отводится синапсину. Этот белок, который состоит из двух полипептидов с молекулярной массой 86 и 80 кД, ассоциирован с цитоплазматической поверхностью мембраны синаптического пузырька. При микроинъекции фосфорилированной формы синапсинов в пресинаптическое окончание гигантского аксона кальмара наблюдается повышение амплитуды и скорости нарастания постсинаптического потенциала, что свидетельствует об увеличении секреции медиатора; дефосфори-лированные формы синапсиноз не вызывали такого эффекта.

Аналогичное увеличение секреции медиатора происходит при микроинъекции Са2+/кальмодулина. Показана способность очищенных синапсинов взаимодействовать в зависимости от состояния фосфорилирования с белками мембраны синаптического пузырька и с F-актином цитоскелета пресинаптического окончания. Предложена следующая схема участия синапсинов в экзоцитозе. В отсутствии деполяризации пресинаптического окончания, когда концентрация Са2+ в цитоплазме низка, де-фосфорилированный синапсин, связанный с цитоплазматической поверхностью пузырька, взаимодействует с цитоскелетом, обеспечивая резервирование и иммобилизацию пузырька. При деполяризации пресинаптической мембраны происходит вход Са2+ в пресинаптическое окончание -> активация Са2+/кальмоду-линкиназы -> фосфорилирование синапсина I -» ослабление связи между синапсином и пузырьком, а также синапсином и F-актином. В результате синаптический пузырек перемещается вдоль микротрубочек на стратегическую позицию v активной

215

зоны.

Далее наступает цепь реакций, обеспечивающих контакт пузырька с пресинаптической мембраной и его плавление. Здесь опять-таки процесс инициируется Са2+, который связывается с другим белком пузырька синаптогамином Именно Са2+-си-наптогамин взаимодействует с фосфолипидами и с комплексом других белков, регулирующих плавление везикулы, — синап-тобревином, синтаксыном и синаптофизином. В заключение происходит активация белка синаптопорина, формирующего пору, какал, через который изливается содержимое везикулы.

В поисках молекулярных механизмов слияния мембраны си-наптического пузырька с пресинаптической мембраной выявлено, что ботулинический и столбнячный токсины, блокирующий экзоцитоз нейромедиаторов из синаптических пузырьков, повреждают именно указанную выше триаду белков пузырька — синаптобревин, синтаксин и SNAP-25.

Ряд других деталей конечного этапа экзоцитоза пока не выяснен. Существует предположение, что выброс нейромедиаторов происходит при активном сокращении стенок пузырька с участием актомиозин