Биологический каталог




Нейрохимия: Учебник для биологических и медицинских вузов

Автор И.П.Ашмарин, А.Е.Антипенко, В.В.Ашапкин, Г.Г.Вольский, С.А.Дамбинова и

х клонов), т.е. одинаково экспрессируемые во всех исследованных тканях (мозг, печень, почка) и, скорее всего, кодирующие так называемые белки "домашнего хозяйства", необходимые для жизнедеятельности любой клетки; II — регулируемые (-26%), т.е. экспрессируемые в клетках всех трех тканей, но в разной степени; III — мозгоспецифические (-30%), т.е. экспрессируемые только в клетках мозга; IV — редкие (-26%), т.е. присутствующие в мозге в количестве, недостаточном для строго воспроизводимого обнаружения использованным методом. Если считать мозгоспецифическими РНК III и IV классов, в эту категорию попадает более половины синтезируемых в мозге мРНК, что хорошо согласуется с оценками, полученными с помощью методов суммарной ДНК-РНК-гибридизации.

¦ Важно отметить, что определение нуклеотидной последовательности клонированных мозгоспецифических мРНК позволяет воспроизвести аминокислотную последовательность кодируемого белка.

Такой анализ был осуществлен Сатклиффом, например, для одного из клонов, кодирующих РНК III класса (р1В236) . Этот клон гибридизуется с моз-госпеиифической мРНК, присутствующей в разных отделах мозга крысы, но в разном количестве. Кодируемый этой РНК полипептид не содержит участков гомологии с ранее изученными белками.

С помощью антител к синтетическим фрагментам этого полипептида изучена его локализация в мозге. Он обнаружен в аксонах, иннервирующих клетки Пуркинье в мозжечке, пирамидные нейроны поля САЗ гиппокампа; в радиальных волокнах глубоких слоев цингулярной и соматосенсорной коры; в группах волокон свода, стриатума, латерального обонятельного тракта и других структур. Источником этих волокон являются нейроны медиального ядра трапециевидного тела, центральной покрышки моста, вентромедиального и базальноаркуатного ядер гипоталамуса, а также нейроны, разбросанные по другим структурам.

Эту работу Сатклиффа и соавторов можно считать образцом технически выполнимой и универсальной методологии поиска новых мозгоспецифиче-

20

ских мРНК и исследования первичной структуры, мест синтеза и функциональной роли кодируемых ими мозгоспецифических белков.

Особый интерес в этом отношении представляют мРНК III и IV классов, имеющие ограниченную локализацию внутри мозга и его отдельных структур. Судя по содержанию наиболее редких мозгоспецифических мРНК (0,1-0,01 молекул на клетку), они должны транскрибироваться в ограниченных популяциях нервных клеток и, возможно, связаны с узкой функциональной специализацией этих популяций.

Для избирательного клонирования таких РНК в последние годы используют процедуру "вычитания", суть которой заключается в удалении из суммарных препаратов кДНК последовательностей, общих для разных отделов мозга, и последующем клонировании такого "вычтенного" препарата кДНК. Так, уже клонированы мРНК, имеющие ограниченное распространение в неокортексе обезьян, но их изучение еще только начинается.

В 1991 г. в лаборатории J.С.Venter (США) начато составление всеобъемлющего каталога генов, экспрессирующихся в мозге человека. Для этого авторы, осуществляют крупномасштабное сиквенирование клонов из библиотек кДНК мозга человека и его частей. К настоящему времени они получили частичные последовательности для примерно 3000 клонов, большинство из которых (около 2500) являются ранее не известными. Ближайшей задачей является картирование соответствующих генов в хромосомах человека и использование полученных данных для идентификации генов, ответственных за различные наследственные заболевания.

1.6.1. Характеристическая последовательность нуклеотидов в РНК мозга

Несколько мозгоспецифических клонов из коллекции Сатк-лиффа и соавторов проявляли необычный характер гибридизации с препаратами поли(А)+РНК, узнавая в них общую короткую (-160 нуклеотшюв) мозгоспецифическую РНК (ВС1). Эта малая РНК найдена во всех отделах мозга крыс, хотя и в неодинаковых количествах. Анализ нуклеотидной последовательности нескольких клонов показал, что единственным общим ддя них элементом является консервативная 82-нуклеотидная последовательность, которая и ответственна за гибридизацию с ВС1 РНК (рис.1.1). Инвариантными в этой последовательности являются 51 нуклеотид] еще 24 нуклеотида одинаковы в 90% проанализированных клонов. Справа эта последовательность со-

21

седствует с олигонуклеотидами, содержащими в основном остатки аденина. Остальные примыкающие или близкие к ней последовательности в разных клонах совершенно различны. Присутствие одной и той же или сходной нуклеотидной последовательности в разных мозгоспецифических РНК как бы маркирует их, что и послужило основанием для ее обозначения как характеристической ("identifier (ID) seguence"). Эта последова-тельностьприсутствует в некодирующих областях многих генов и соответствующих пре-мРНК и в большинстве случаев удаляется при пронессинге последних. Ее функция до сих пор неизвестна, хотя есть основания полагать, что она служит неспецифическим стимулятором транскрипции содержащих ее генов. В любом случае ID-последовательность не является нейроспеци-фическим регулятором транскрипции, поскольку она присутствует и в многих пре-мРНК соматических тканей.

GGGGYTGGGGATff AGCTCAGTG^

*«**»•**« #• •»*• # АА *»

GGGTTCGGTCCCCAGCTCCGAAAAAAARAA AAA - CC

Рис. I L Прототипная ID-последовательность крысы: подчеркнуты элементы внутреннего промотора РНК-полимеразы III; звездочками помечены инвариантные нуклеотиды

В препаратах цитоплазматической РНК мозга также обнаружены короткие молекулы РНК, содержащие ID-последовательность: ВС1 (160 нуклеотидов), ВС2 (100-110 нуклеотидов) и ТЗ (75 нуклеотидов). Синтез этих малых РНК осуществляется РНК-полимеразой III, узнающей консервативные участки в ID-последовательности, гомологичные внутреннему промотору генов РНК-полимеразы III (см. рис. 1.1.). Обнаруженные в клетках эукариот малые РНК, как показано в последние годы, играют важнейшую роль в таких процессах, как сплайсинг и З'-про-цессинг пре-мРНК, трансляция и трансмембранный транспорт секретируемых белков и т.п.

1.6,2. Альтернативный процессинг пре-мРНК в мозге

Альтернативный процессинг заключается в образовании различных зрелых мРНК из одного первичного транскрипта в результате соединения различных комбинаций экзонов (альтернативный сплайсинг) и/или использования различных сигналов полиаденили-рования (альтернативный 3'-процессинг). Одним из наиболее 22

хорошо изученных случаев использования альтернативного сплайсинга для образования различных продуктов в разных клетках является система синтеза регуляторных пептидов, кодируемых геном кальцитонина (СТ). Этот ген кодирует небольшое семейство пептидов, два из которых {кальцитонин и катакаяь-цин) преимущественно образуются в клетках щитовидной железы, а третий (CGRP-calcitonin gene-related peptide) — в клетках нервной системы (см. о нейропептидах гл.9).

Исследование структуры гена кальцитонина и зрелых мРНК, кодирующих эти пептиды у крысы и человека, показало, что I-III экзоны являются общими для этих мРНК. IV экзон, кодирующий кальцитонин и катакальцин, присутствует только в мРНК кальцитонина и содержит специфический для нее сигнал полиаденилирования, а V и VI экзоны, содержащие CGRP-кодирующую и 3'-некодирующую последовательности, включая специфический для CGRP-мРНК сигнал полиаденилирования, присутствуют только в CGRP-мРНК (рис. 1.2). Механизмы выбора различных путей сплайсинга первичного транскрипта CT/CGRP-гена в клетках щитовидной железы и нейрона пока еще остаются неясными и сейчас интенсивно изучаются.

Общие экзоны 5'-

СТ-кодиру- CGRP-кодиру- CGRP-3-некоди-

ющий экзон ющий экзон рующий экэон

1 ii HI

ст

CGRT

поли (А)

Транскрипция, полиаденилирование, сплайсинг Щитовидная железа ^^00^ Мозг

поли(А)

СТ-мРНК

1 ii iii ст

iii

CGRP

поли (А)

Рис. 1.2. Тканеспецифический альтернативный сплайсинг в экспрессии гена кальцитонина крысы

Альтернативный сплайсинг первичных транскриптов обеспечивает также разнообразие белков миелина в ЦНС млекопитающих. В частности, показано, что различные основные белки миелина (21,5, 18,5, 17 и 14 кД) у мыши кодируются одним геном shi-локуса: при этом белок 21,5 кД кодируется мРНК, содержащей последовательность всех 7 экзонов гена, белок

23

18,5 кД — всех, кроме II экзона, белок 17 кД — всех, кроме VI экзона, а белок 14 кД — всех, кроме II и VI экзонов. При этом образующиеся белки идентичны по аминокислотным последовательностям, кодируемым общими экзонами.

Еще одним примером служит так называемый РРТ ген крысы, который кодирует препротахикинины а- и р-типов — предшественники целого семейства нейропептидов — тахикининов. Первый из них содержит последовательность вещества Р, а второй — вещества Р и вещества К. Анализ первичной структуры показал, что эти РНК образуются в результате альтернативного сплайсинга по экзонам, кодирующим вещество К.

Разнообразие потенциал-зависимых и лиганд-зависимых ионных каналов в мембранах нервных клеток обеспечивается существованием кодирующих такие каналы мультигенньгх семейств (например, потенциал-зависимые Na-каналы) и опять-таки альтернативным сплайсингом (потенциал-зависимые К-каналы). Один и тот же ген у дрозофилы кодирует четыре по-липеггтидные цепи, участвующие в формировании функционально активного К-канала. Эти полипептиды имеют одинаковые центральные домены, содержащие характерные для потенциал-зависимых каналов элементы.

Как и в описанных выше системах, разные полипептидные цепи К-канала возникают в результате альтернативного сплайсинга одного первичного транскрипта. Для формирования функционально активного К-канала необходима ассоциация четырех одинаковых или разных полипептидов: очевидно, что комбинирование различных полипептидов может обеспечить широкое разнообразие различающихся по физиологически значимым параметрам (например динамике инактивации-реактивации) каналов.

Еще один яркий пример использования альтернативного сплайсинга — образование семейства синаптических рецепторов глутаминовой кислоты. Каждый из четырех рецепторов этого семейства (GluR-A, -В, -С, -D) с

страница 5
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95

Скачать книгу "Нейрохимия: Учебник для биологических и медицинских вузов" (21.4Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(23.09.2019)