единица фермента содержит два центра связывания нук-леотида.

Регуляторная N-концевая половина молекулы протеинкиназы G сходна с семейством цАМФ-связывающих белков (Р субъединицей протеинкиназы А), в то время как каталитическая С-

347

концевая половина родственна группе киназ с различной специфичностью. Протеинкиназа G способна к аутофосфорилиро-ванию из расчета 2 моля фосфата на 1 моль холофермента. Ау-тофосфорилирование не изменяет сродства к цГМФ и незначительно повышает VMaKC фосфотрансферазной реакции, но заметно увеличивает сродство протеинкиназы G к цАМФ. Таким образом, аутофосфорилирование может обусловливать регуляцию протеинкиназы G не только с помощью цГМФ, но и цАМФ.

Протеинкиназа G фосфорилирует, вероятно, те же аминокислотные остатки в молекуле субстрата, что и протеинкиназа А, но с гораздо меньшей скоростью. Различная скорость фосфорилирования протеинкиназ А и G может являться основой их субстратной специфичности.

Как упоминалось, наибольшее содержание протеинкиназы G в нервной ткани отмечено в мозжечке (в 30-40 раз выше, чем в других отделах мозга). В свою очередь, в этом отделе мозга фермент локализован в клетках Пуркинье. Найдена корреляция между увеличением содержания G-киназ в цитоплазме клеток Пуркинье, началом роста дендритов и установлением си-наптических контактов в клетках Пуркинье и подобных им субкортикальных клетках, что может свидетельствовать в пользу безусловной значимости цГМФ-зависимого фосфорилирования для нейрональной дифференцировки этих клеток. В клетках Пуркинье находится и единственный в мозге млекопитающих специфичный субстрат для протеинкиназы G (К^ для протеинкиназы А при фосфорилировании этого белка на порядок выше), названный G-субстратом; G -субстрат — кислоторастворимый и термостабильный белок с Мг = 23 кД. Обнаружено, что фос-форилированный с помощью цГМФ-зависимой протеинкиназы G-субстрат ингибирует протеинфосфатазу, выделенную из мозжечка, являясь специфичным для клеток Пуркинье проте-инфосфатазным ингибитором. При этом ингибируемая фосфа-таза из этих клеток, вероятно, катализирует дефосфорилирова-ние белков, не являющихся субстратами протеинкиназы А.

Увеличение уровня цГМФ обусловлено взаимодействием с плазмалеммой различных гормонов и нейромедиаторов. Так активируется связанная с мускариновыми рецепторами гуанилат-циклаза. Активация гуанилатциклазы обычно обусловлена мобилизацией Са2+ из эндоплазматического ретикулума.

В клетках мозга обнаружен термостабильный белок, стимулирующий активность протеинкиназы G, но не изменяющий активность протеинкиназы А. Обратный процесс — инактивация протеинкиназы G состоит в гидролизе цГМФ фосфодиэ-

348

стеразой, специфичной для этого нуклеотида. Кроме того, в тканях млекопитающих, в том числе и нервной, найден ингибитор G-киназы с Мг = 15 кД.

Отметим, что системы циклических нуклеотидов осуществляют внутриклеточную регуляцию в тесном взаимодействии друг с другом. Так, например, если концентрация цАМФ в клетке длительное время повышена, может происходить фосфорилирование белков, встроенных в каналы плазматической мембраны, что приводит к повышению в цитоплазме концентрации Са2+. В результате этого активируются фосфодиэстераза и гуа-нилатциклаза; соответственно ускоряется гидролиз цАМФ и образуется цГМФ.

¦ Итак, цГМФ играет важную роль в нервной системе, особенно в клетках Пуркинье мозжечка. Об этом свидетельствует избирательная локализация в этих клетках всех компонентов системы цГМФ, включая гуанилатциклазу, протеинкиназу G и G-субстрат. Различные нейромедиаторы, в том числе ацетилхолин, вызывают увеличение уровня цГМФ в клетках Пуркинье и активацию G-киназы, что, по всей видимости, модулирует такие свойства этих клеток, как скорость проведения возбуждения и способность к стимуляции.

Установлено также, что цГМФ модулирует активность ионных каналов мембран нервных клеток. Так, введение в нейроны улитки цГМФ или G-киназы увеличивает проводимость Са-каналов.

10.3. Са-КАЛЬМОДУЛИН-ЗАВИСИМОЕ ПРОТЕИНФОСФОРИЛИРОВАНИЕ

Как упоминалось, в процессе эволюции выработались эффективные механизмы удаления Са2+ во внеклеточное пространство или специализированные внутриклеточные структуры. Низкая внутриклеточная концентрация Са2+ позволила клеткам использовать "впрыскивание" Са2+ в цитоплазму как сигнал на внешние воздействия. При этом кальций может быть даже более универсальным внутриклеточным регулятором (вторичным посредником), чем цАМФ. Так, период действия Са2+ очень короток и измеряется миллисекундами, а не секундами, как в случае цАМФ. Как стало понятно в последнее время, обе системы вторичных посредников функционируют в тесном взаимодействии.

Для внутриклеточной "реализации" кальциевого сигнала в процессе эволюции созданы специальные внутриклеточные бел-

349

ковые рецепторы Са2+, способные опосредовать действие этого иона на молекулярные мишени. Основным рецептором Са2+ во всех клетках является кальмодулин. Кальмодулин (КМ) —глобулярный белок сМг- 16,5 кД. Структурно он очень консервативен: так, обнаружено только шесть или немногим более аминокислотных замен в кальмодулине, выделенном из живых объектов, эволюционно разделенных миллионами лет. Кальмодулин содержит 4 Са-связывающих участка: в состав каждого из этих участков входят кислые остатки аминокислот, необходимые для связывания Са2+ и обусловливающие низкое значение изоэлектрической точки KM (pl~4,0). Фосфорилированных форм КМ не обнаружено.

Кальмодулин локализован главным образом в цитоплазме, а также ассоциирован с различными клеточными структурами, микротрубочками и мембранами, включая постсинаптические мембраны. Внутриклеточное распределение КМ регулируется циклическими нуклеотидами. Так, цАМФ-зависимый транспорт Са2+ через клеточные мембраны может изменять сродство КМ к мембранной и цитоплазматической фракциям клетки.

При стимулировании происходит связывание Са2+ с КМ. В результате кальмодулин претерпевает конформационные изменения: экспонирование гидрофобного участка при этом — важное условие для последующего взаимодействия КМ с акцепторными белками (белками-исполнителями). Среди ферментов-исполнителей, активность которых модулируется в присутствии КМ, непосредственное отношение к регуляторным реакциям внутриклеточного протеинфосфорилирования имеют Са-КМ-зависимые протеинкиназы (протеинкиназы В), аденилатцикла-за, фосфодиэстераза циклических нуклеотидов и КМ-зависи-мая протеи нфосфатаза.

На первый взгляд, способность КМ во многих тканях (в том числе и нервной) активировать системы как синтеза, так и деградации цАМФ выглядит парадоксом. Однако локализация ферментов аденилатциклазы в мембране, а фосфодиэстеразы в пи-тозоле обусловливает преимущественную Са-активацию аденилатциклазы. Кроме того, для полной активации аденилатциклазы достаточно комплекса КМ-Са2+, а для фосфодиэстеразы (и киназы легких цепей миозина) необходимо заполнение третьего, а возможно, и четвертого Са-связывающего участка КМ. Это означает, что аденилатциклаза активируется при более низких концентрациях Са2+.

Результатом действия Са2+ и кальмодулина часто является фосфорилирование, катализируемое Са-КМ-зависимыми про-

350

теинкиназами. К настоящему времени обнаружено 3 тина КМ-зависимых протеинкиназ В, которые в порядке убывания молекулярной массы обозначаются как протеинкиназы В I, II и III. Основные различия этих типов протеинкиназы В относятся к их субстратной специфичности. Так, протеинкиназа В I типа фос-форилирует лишь несколько белков в нервной ткани, в то же время для киназы II типа только в головном мозге найдено более 10 субстратов. Сродство этих протеинкиназ к КМ практически одинаково (20-40 нМ), что свидетельствует об одинаковой структуре КМ-узнающего участка фермента.

В нервной ткани, где концентрация Са-КМ-зависимых протеинкиназ особенно высока, обнаружены специфические изо-ферменты В-киназ I и II типа. Так, в мозге быка найдено, по меньшей мере, 3 изофермента В-киназы I типа (37,39 и 42 кД). Высокомолекулярные олигомерные В Н-киназы из лобных долей мозга и мозжечка отличаются по субъединичному составу. Если первый фермент состоит из субъединиц а и р с Мг = 50/55 и 60/65 кД в молярном соотношении 3:1, то В-киназа из мозжечка имеет другое соотношение этих субъединиц — 1:4. Гетерогенность и высокая концентрация В-киназ в нервной ткани может обусловливать физиологическую значимость Са-КМ-за-висимого фосфорилирования в клетках нервной системы.

Как установлено, протеинкиназа В II типа составляет примерно 0,4% от общего белка головного мозга млекопитающих, что свидетельствует о важной регуляторной роли фермента в этом отделе ЦНС. В-киназа II типа преимущественно связана с мембранной фракцией в отличие от "цитоплазматической" киназы В I типа. Мембраносвязанный фермент II типа сконцентрирован в области постсинаптического уплотнения в тех отделах нервной системы, которые связаны с обучением (гиппо-камп у позвоночных и сенсорные нейроны у беспозвоночных). Киназа В II типа обладает свойствами двухфазного переключателя со стабильностью, необходимой для кодирования долговременной памяти.

КМ-зависимые протеинкиназы могут быть разделены на 2 группы по структурным особенностям. Так, в одной группе КМ является интегральной частью фермента, а в другой — способен обратимо диссоциировать от протеинкиназы. Примером первого случая может служить киназа фосфорилазы, tlpn активации фермента Са2+ связывается с субъединицей фермента, являющейся кальмодулином. Около 20 лет назад было обнаружено стимулирующее действие на киназу фосфорилазы протеинкиназы А. К настоящему времени установлено, что 10-20-

351

кратное увеличение активности фермента может быть вызвано цГМФ-зависимой и КМ-зависимой нротеинкиназами. Участие экзогенного КМ в регуляции активности киназы фосфорилазы происходит только при отсутствии стимулов, приводящих к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ. Гликоген и ферменты его метаболизма присутствуют в глии и нейронах: электростимулируемое расщепление гликогена в нервной ткани регулируется посредством активации киназы фосфорилазы.

Кяназа легких цеп