в обусловливает регуляцию Са-зависимой секреции нейромедиаторов.

В-50-белок (Мг~48 кД) ассоциирован с пресинаптическими мембранами нейронов мозга. Как недавно установлено, этот белок проявляет активность фосфатидилинознтол-4-фосфат киназы — фермента, участвующего в синтезе фосфатидилинози-толдифосфата (субстрата фосфолипазы С). Таким образом, передача сигнала через систему фосфатидилинозитола в мозге может регулироваться с помощью фосфорилирования В-50-белка протеинкиназой С.

Протеинкиназа С, по-видимому, регулирует как хемозависи-мые7 так и электрозависимые Са-каналы в нервных клетках. Так, искусственные аналоги диацилглицерина — форболовые эфи-ры — в задних корешках спинного мозга, блокируют хемозави-симые Са-каналы в концентрациях, при которых эти соединения активируют протеинкиназу С. Установлено также, что внутриклеточная инъекция протеинкиназы С увеличивает амплитуду электрозависимого Са-тока и уменьшает Са-активируемый калиевый ток в нейронах моллюска аплизии. При этом, по имеющимся данным, С-киназа (так же, как и киназы В и G) преимущественно фосфорилирует регуляторные компоненты мембран, сопряженные с каналами, а не пептиды, формирующие собст-

360

веяно трансмембранные каналы (напротив, А-киназа модулирует свойства Са-каналов с помощью фосфорилирования белковых компонентов этих каналов). Таким образом, приведенные данные о влиянии на секрецию нейромедиаторов и трансмембранные потоки ионов свидетельствуют о непосредственном участии С-киназы в важнейших процессах нервной ткани.

Оценивая место протеинкиназы в системах регуляции, отметим, что существуют два варианта взаимодействия между системами вторичных посредников, определяемые как состоянием рецепторов, так и распределением в разных тканях, природой и условиями для фосфорилирования отдельных белков-мишеней: синергизм и антагонизм. Протеинкиназа С, по всей видимости, является тем звеном, которое путем тонкой подстройки сопрягающего аппарата связывает аденилатциклазную и фосфолипаз-ную системы передачи и усиления сигнала.

Так, обнаружено фосфорилирование протеинкиназой С а-субъединицы G{, ведущее к снятию ингибиторного действия этого сопрягающего белка на аденилатциклазу. Кроме того, уже упоминалось, что G{ может быть одним из прямых активаторов фосфолипазы С. Непрямая активация фосфолипазы С может быть обусловлена увеличением активности фосфолипазы А2 при действии Gi (в свою очередь, продукты гидролиза фосфолипазы А2 активируют фосфолипазу С). Показано ингибирование фосфолипазы С посредством активации Gs. Так, установлено уменьшение образования диацилглицерина и инозитолтрифосфата при повышении уровня цАМФ с помощью гормонов, ди-бутирил-цАМФ, форсколина. Вероятно, угнетение активности протеинкиназы С при активации протеинкиназы А обусловлено десенситизацией соответствующих рецепторов, потерей их чувствительности к агонистам. В пользу такого заключения свидетельствуют данные о потере специфического связывания с агонистами мускариновых холинорецепторов синаптических мембран при фосфорилировании этих рецепторов К-субъеди-ницей протеинкиназы А. В свою очередь, стимуляция М-холи-норецепторов сердца вызывает уменьшение активности адени-латциклазы и снижение уровня цАМФ.

Вместе с тем известны и примеры синергизма во взаимодействии протеинкиназ. Синергизм в действии протеинкиназ А, В и С отчетливо проявляется при фосфорилировании фосфоламбаиа — белка саркоплазматического ретику-лума миокарда. Показано увеличение индуцированного инозитолтрифосфа-том высвобождения Са2+ под действием К-субъединицы протеинкиназы А, ингибитор К-субъединицы блокирует этот эффект Установлено также, что протеинкиназа С в некоторых типах клеток потенциирует р-адренергическую стимуляцию образования иАМФ. Преинкубация эндотелиальных клеток в присутствии 10 мкм (3-агониста изопротеренола вызывает активацию фосфо-

361

липазы С под действием гистамина. Протеинкиназа С может модулировать взаимодействие сопряженных систем вторичных посредников и через фосфо-диэстеразу; так, при фосфорилировании протеинкиназой С фосфодиэстеразы цАМФ теряется чувствительность этого фермента к цГМФ.

Показана возможность влияния протеинкиназы С на фосфорилирование белков через фосфорилирование ею протеин-фосфатаз, при этом особенно интригующим является фосфорилирование кальцинейрина — основной протеинфосфатазы нервной ткани. Фосфорилирование протеинкиназой С кальцинейрина может обеспечивать обратную связь в проявлении эффектов протеинкиназы С и протеинкиназы А: как известно, аутофосфорилированная форма протеинкиназы АII типа является предпочтительным субстратом для кальцинейрина.

10.5. ФОСФОПРОТЕИНФОСФАТАЗЫ

Все изложенное выше свидетельствует о том, что протеин-фосфорилирование —важнейший механизм регуляции целого ряда внутриклеточных процессов. Степень фосфорилирования любого белка определяется относительной активностью протеинкиназ и протеинфосфатаз, катализирующих, соответственно, включение или удаление фосфата, связанного с белком. Хотя фосфопротеинфосфатазы гораздо менее изучены, чем протеинкиназы, ясно, что эти ферменты также играют ключевую роль в регуляции клеточных функций. Активность фосфопротеинфос-фатаз регулируется по "внешнему" (субстратному) и "внутреннему" (фосфатазному) механизмам. В первом случае различные метаболиты связываются с субстратом (фосфопротеином), изменяя скорость дефосфорилирования; во втором случае лиган-ды связываются с фосфатазой и, таким образом, прямо изменяют фосфатазную активность.

Изучение фосфатаз привело к открытию множества форм фермента, которые дефосфорилируют широкий спектр фосфо-белков. Д.Коэн и соавторы (1984) классифицировали протеинфосфатазы на два типа. Фосфатазы 1-го типа ингибируются белковыми инибиторами, относительно нечувствительны к ин-гибированию АТФ и предпочтительно дефосфорштируют р-субъ-единицу киназы фосфорилазы. Фосфатазы 2-го типа не ингибируются термостабильными белковыми ингибиторами, чувствительны к ингибированию АТФ и преимущественно дефосфорилируют а-субъединицу киназы фосфорилазы. В свою очередь, все фосфопротеинфосфатазы 2-го типа делятся на подтипы 2А, 2В и 2С. Отличительной особенностью фосфатаз 2С яв-

362

ляется регулируемость Mg , а фосфатаз 2 В — зависимость от Са2+ и кальмодулина.

Протеинфосфатазы 2 В и 2А присутствуют в мозге в наибольших концентрациях по сравнению с другими тканями. В нервной ткани найдены также специфические протеинфосфатазы, дефосфорилирующие основной белок миелина, синапсин 1, МАР-2, белки цитоскелета, никотиновые рецепторы ацетилхолина. Наибольшая активность фосфопротеинфосфатаз нервной ткани выявлена в мембранной фракции по сравнению с цитозо-лем, что свидетельствует о возможном участии этих ферментов в синаптической передаче.

Заметим, что ранее протеинфосфатаза 2В была названа каль-цинейрином, так как впервые она была идентифицирована в нервной ткани как термолабильный ингибитор КМ-стимулируемой фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов. Кальцинейрин принадлежит к семейству КМ-связывающих белков, содержащих Са-связывающие субъединицы. Активность кальцинейрина контролируется ионами кальция.

Недавно обнаружено, что кальцинейрин, кроме серина и треонина, способен дефосфорилировать также тирозиНовые остатки белков. Это предполагает участие кальцинейрина в процессах трансформации и клеточного роста, контролируемых, как известно, тнрозинкиназами. Интересно, что в N-конце субъединицы В кальцинейрина содержится миристиновая кислота (так же, как и у протеинкиназы С), что может облегчать встраивание белка в мембрану.

В мозге кальцинейрин локализован в основном в иостси-наптических мембранах и тесно связан с микротрубочками ден-дритов, что предполагает его участие в транссинаптической передаче и функционировании микротрубочек. Основными субстратами кальцинейрина в нервной ткани являются белки DARPP-32, G-субстрат и Р-субъединица II типа протеинкиназы А.

В мозге содержатся также ингибиторы протеинфосфатаз: так называемый фосфатазный ингибитор 1 и белок DARPP-32 (дофамин- и цАМФ-регулируемый фосфобелок с Мг = 32 кД) найдены в мозге и фосфорилируются эндогенной А-киназой по единственному остатку треонина. В фосфорилированной (но не дефосфорилированной) форме DARPP-32, как и фосфатазный ингибитор 1, ингибирует активность протеинфосфатазы I. DARPP-32 сопряжен в мембранах с дофаминовыми рецепторами аденилатциклазы и, таким образом, может принимать участие в транссинаптическом действии дофамина.

Кальцинейрин и DARPP-32 локализованы вместе в синап-

363

тических мембранах. Следовательно, степень фосфорилирования DARPP-32 и медиаторное действие дофамина могут регулироваться цАМФ и Са2+ (в последнем случае посредством активации кальцинейрина).

Отметим, что кальцинейрин может выступать в роли своеобразного антагониста биохимических эффектов цАМФ, модулируя тем самым взаимодействие двух систем вторичных посредников — цАМФ и Са2+. Так, кальцинейрин дефосфорили-рует многие субстраты протеинкиназы А, в том числе аутофос-форилированную форму регуляторной субъединицы протеинкиназы АII типа. В последнем случае кальцинейрин может прямо контролировать цАМФ-зависимую протеинкиназную активность, так как степень фосфорилирования Р-субъединицы II типа определяет характер диссоциации холофермента протеинкиназы и. соответственно, скорость фосфорилирования.

цГМФ регулирует активность протеинфосфатаз 1 и 2А в клетках Пуркинье мозжечка с помощью фосфорилирования G-суб-страта протеинкиназой G. G-субстрат, как упоминалось, является специфическим протеинфосфатазным ингибитором. Де~ фосфорилирование этого ингибитора кальцинейрином может, таким образом, сопрягать влияние цГМФ и Са2^ на функциональную активность клеток Пуркинье.

В синаптических мембранах обнаружены также две эндогенные, тесно связанные с этими мембранами специфические про-теинфосфатазьг Эти протеинфосфатазы дефосфорилируют белки синаптических мембран: синапсин 1 и Р-субъединицу II типа протеинкиназы А. При этом фосфатаза, имеющая высокое сродство к Р-субъединице, не дефосфорилирует синапсин 1, а фосфатаза синапсина 1 —Р-субъединицу. Кроме то