Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

ставить экстракт стоять на несколько минут и затем отцентрифугировать. В результате удаления из экстракта большого количества нуклео-протеидов и нерастворимых частиц нередко удается превратить мутный экстракт в совершенно прозрачный раствор. Правда, иногда при этом случайно может быть осажден тот или иной фермент.

Б. ФРАКЦИОННАЯ ДЕНАТУРАЦИЯ НАГРЕВАНИЕМ

Это другой способ обработки, иногда весьма удобный как предварительная ступень при работе с относительно термостйе бильными ферментами. Тепловая^енатурация белков характеризуется высоким значением температурного коэффициента; поэтому температура, вызывающая разрушение, обычно достаточно четко ограничена и различна для—каждого белка. Прогревая раствор в течение определенного времени при температуре немного ниже той, пр?гкотсттой- фермент разрушается, можно иногда вызвать»-коагуляцию большого количества балластного белка, а затем отделить этот белок на центрифуге и отбросить. Можно также использоватьГспецифический стабилизирующий эффект субстрата. В присутствии_?уЛс_трата раствор фермента удается иногда нагреть на 10"*ТТвыше той температуры, которая в отсутствие субстрата вызывает разрушение фермента. Это дает возможность избавиться'от большого количества балластных белков [216, 635].

Для нагревания лучше всего иметь три водяные бани: одну с желаемой температуройТ^ш^с несколько более высокой температурой н одну холодную. Раствор наливают в круглодонную колбу, которая должна быть наполнена не больше, чем наполовину; колбу помещают в наиболее горячую баню и быстро вращают так, чтобы раствор ни в одной части не перегревался. За температурой раствора все время следят и, как только раствор нагреется до желаемой температуры, колбу переносят в баню с той же температурой, где и оставляют на определенный срок (в первой бане тем временем нагревается следующая порция раствора). После окончания прогревания колбу переносят » холодную баню, где также вращают, чтобы быстро охладить ее содержимое на несколько градусов. После этого раствор-можно оставить стоять до тех пор, пока он совсем не остынет.. Время нагревания составляет обычно 10—15 мин.

Выделение ферментов В. ФРАКЦИОННОЕ ОСАЖДЕНИЕ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ

Фракционирование органическими растворителями — один из стандартных приемов разделения белков. Кон и его сотрудники [828] для разделения белков крови широко использовали этанол. Исследуя возможность применения различных растворителей для разделения ферментов мышечного экстракта, Ас-конас [171] пришла к заключению, что самое четкое разделение и наименьшие потери дает ацетон. Для получения хороших результатов при фракционировании белков ацетоном требуется низкая концентрация электролитов (менее чем М/30), и поэтому желательно предварительно белковый раствор диализовать. Раствор, однако, не должен быть полностью свободен от электролитов, иначе осадки не удастся отцентрифугировать. Было найдено, что наилучшие результаты при работе с мышечной тканью получаются, когда рН поддерживается на уровне 6,5.

Поскольку большинство ферментов инактивируются органическими растворителями при комнатной температуре, необходимо принимать специальные меры для поддержания низкой температуры на всем протяжении работы. Раствор фермента помещают в металлический сосуд из нержавеющей стали или алюминия, снабженный хорошей мешалкой и погруженный в баню, температура которой поддерживается на уровне —5°С. Ацетон находится в мерном цилиндре, также погруженном в баню, и под небольшим давлением воздуха выталкивается маленькими порциями через капилляр на стенку металлического сосуда. Он стекает тонким слоем по холодной металлической поверхности до смешивания с белковым раствором. Добавление растворителя начинают сразу же после того, как температура раствора упадет до 0°С (чтобы предупредить замерзание), и продолжают до получения желаемого количества осадка для первой фракции (или пока не будет достигнута желаемая концентрация ацетона). Затем раствор центрифугируют в центрифуге с охлаждением при той же самой температуре (обычно достаточно нескольких минут). Центрифугат вновь помещают в металлический сосуд и продолжают добавление ацетона. Осадок либо подвергают лиофильной сушке, либо немедленно растворяют в достаточном количестве холодной воды или буфера, для того, чтобы разбавить ацетон до безвредной концентрации; можно также подвергнуть раствор диализу на холоду (при температуре замерзания воды).

Определение ферментативной активности проводят в растворенных белковых фракциях. Нельзя определять активность фермента в основном растворе, из которого ведется осаждение белков, поскольку возрастающая концентрация ацетона может оказывать значительное влияние на результаты. Глава 3

Некоторые ферменты очень устойчивы к ацетону. При работе с ними выгодно оставить раствор с ацетоном стоять при комнатной температуре: ацетон вызовет интенсивную денатурацию и инактивацию сопутствующих белков и ферментов, после чего их можно удалить.

Г. ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ СОЛЯМИ

Фракционирование солями применяется очень широко. Чаще всего для фракционирования белков употребляют сульфат аммония, так как он хорошо растворим в воде и на большую часть ферментов не оказывает вредного действия. Более того, на многие ферменты он оказывает даже стабилизирующее действие, и потому при работе с ним нет необходимости проводить фракционирование белков при низкой температуре. Часто количество выделяемого фермента во всех фракциях в сумме составляет 100%, но обычно при разделении жертвуют некоторым количеством фермента в отбрасываемых фракциях, чтобы обеспечить большую чистоту.

Для фракционирования белков целесообразно пользоваться сульфатом аммония хорошего качества, чтобы не вносить в раствор токсичных примесей или свободной кислоты, имеющейся в некоторых образцах соли. Даже чистые препараты сульфата аммония имеют слабокислую реакцию; поэтому следует тщательно контролировать рН. Для того чтобы не увеличивать объем, к белковому раствору обычно добавляют твердую соль.

Фракционирование опытной пробы удобно проводить, поместив раствор фермента в центрифужную пробирку, а твердый сульфат аммония — в обычную пробирку. Пробирку с сульфатом аммония взвешивают и к раствору фермента добавляют такое количество соли, которое способно осадить белок в количестве, достаточном, чтобы составить одну фракцию. При этой процедуре внимательно следят за тем, чтобы растворился весь добавленный сульфат аммония. Затем вновь взвешивают пробирку с оставшимся сульфатом аммония. Разница в весе соответствует весу соли, добавленной к раствору фермента. При осаждении белков сульфатом аммония рекомендуется выждать не менее 15 мин, а если возможно, то и дольше, до начала центрифугирования; в противном случае не будет четкого разделения фракций. Осадки не всегда легко отделяются на обычной центрифуге, и может оказаться желательным использовать скоростную центрифугу (10 000 об/мин). Эти осадки обычно хорошо отделяются на складчатых бумажных фильтрах под собственным давлением, но такая процедура занимает много времени. Фильтрование с отсасыванием обычно неэффективно, если не используются дополнительные фильтрующие средства, однако эти последние могут адсорбировать часть фермента, и поэтому они не

Выделение ферментов годятся при фракционировании малых объемов, хотя в работе с большими объемами их применяют вполне успешно.

После того как первая фракция отцентрифугирована, раствор переносят в другую центрифужную пробирку и продолжают добавление соли. Осадок растворяют в малом объеме воды или буферного раствора.

В полученном растворе белка проводят определение ферментативной активности; нецелесообразно проводить определение активности в маточном растворе, остающемся после осаждения определенных фракций, из-за высокой концентрации содержащейся в нем соли.

Обычно при повторении пробного фракционирования на основной массе раствора трудностей не возникает. Можно сэкономить немного времени на процедуре отвешивания соли. Известно, что обычные мелкие кристаллы Сульфата аммония вместе с заключенным между ними воздухом имеют плотность около 1, так что если заполнить мерный цилиндр сульфатом аммония, то деления укажут число граммов последнего. Этот метод недостаточно точен, чтобы заменить взвешивание, но он помогает быстро отмеривать приблизительное количество соли.

При описании""методов выделения ферментов количество сульфата аммония обычно выражают в процентах насыщения и часто употребляют выражение вроде «... фракция, осажденная между 55 и 60% насыщения». Правильно рассчитать количество соли, которое нужно добавить к данному объему раствора, чтобы получить указанный процент насыщения,— отнюдь не простое дело. Поскольку при растворении соли меняется объем жидкости, количество соли, которое нужно добавить к данному объему жидкости, не пропорционально требуемому проценту насыщения. Так, например, количество соли, которое нужно добавить, чтобы получить 50% насыщения, составляет только 41%, а не 50% того количества, которое требуется для 100%-ного насы

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.11.2019)