ном перемешивании механической мешалкой. Надосадочную жидкость отсосать, осадок 4 раза промыть порциями воды по 3 л каждая. К осадку, суспендированному в 3 л воды, добавить 100 мл 40%-ного (по весу) NaOH и суспензию кипятить в течение 1 ч при помешивании. Дать осадку в течение 5 мин осесть, после чего надосадочную жидкость отсосать и осадок в течение 5 мин взбалтывать с 4 л воды. Эту процедуру повторить 3 раза. Затем к осадку прилить 4 л 0,01 М фосфатного буфера, рН 6,8 и довести смесь почти до кипения при постоянном перемешивании. Вновь дать взвеси осесть в течение 5 мин, после чего надосадочную жидкость отсосать. Эту процедуру повторить 1 раз с 0,01 М и 2 раза с 0,001 М фосфатным буфером, каждый раз кипятить суспензию в течение 15 мин. При хранении в 0,001 М фосфате препарат стабилен в течение года. Глава 3

10 мМ фосфатным буфером с нейтральным значением рН, соотношение фосфата кальция и белка должно составлять примерно 5:1 (по весу). В этих условиях многие белки адсорбируются на поверхности геля. Далее проводят элюцию выделяемого фермента либо с помощью солевого градиента, либо ступенчатой элюцией, т. е. возрастающими концентрациями того же фосфатного буфера. Описание применения колонок с фосфатом кальция дано в работе [4753].

Для ионообменной хроматографии ферментов обычно используют производные целлюлозы или смолы. Могут быть использованы целлюлозы либо «волокнистые» с нативной, относительно неизмененной физической структурой полисахаридов, либо «микрогранулированные», из которых удален аморфный материал, а полисахаридные цепи сшиты поперечными связями химическими методами. Микрогранулированные формы более тонко измельчены, и при их упаковке получают более компактные колонки, однако при повторном использовании они требуют более тщательной обработки, чем волокнистые материалы. В последнее время целлюлозные гели используют в качестве матрицы для прикрепления ионообменных групп [1069].

КатионообмеИники, используемые для хроматографии, несут отрицательно заряженные группы (например, —О—СН2—СОО~ в карбоксиметшщеллюлозе, —О—СН2—СН2—SO_3 в сульфо-этилцеллюлозе, —СОО- в слабокислых акриловых смолах), присоединенные к матрице; значения рК этих групп находятся в области величин от 2 до 7. Наиболее широко используемыми анионообменниками являются диэтиламиноэтилцеллюлоза [ДЭАЭ; —О—СН2—СН2—N(C2Hs)2], триэтиламиноэтилцеллю-лоза [ТЭАЭ; —О—СН2—СН2—Ы+(С2Н5)з] и эктеола-Целлю-лоза (целлюлоза с присоединенным к ней триэтаноламином); значения рК ионообменных групп этих целлюлоз находятся в области величин от 7 до 10. Плотность заряженных групп на углеводной матрице низкая—она варьирует от 0,1 до 5мэкв/г,— но такая плотность весьма выгодна, так как позволяет проводить элюцию крупных полиэлектролитов в относительно мягких условиях.

Чаще других ионообменников для фракционирования ферментов используются карбоксиметилцеллюлоза (КМ-целлюло-за) и диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза). При работе с катионообменником фермент следует наносить в условиях, способствующих максимальной адсорбции на ионообменни-ке, а именно в буфере, имеющем рН около 5 и содержащем 10 мМ катион (обычно Na+) При рН буфера ниже изоэлектри-ческой точки фермента последний будет нести положительный заряд и образовывать ионную связь с кислотными группами ионообменника. Последующее постепенное увеличение ионной силы и (или) рН элюирующего буфера (до примерно 500 мМ

Выделение ферментов катиона и рН 8) приводит в результате катионного обмена и нейтрализации положительного заряда на ферменте к освобождению фермента из его связи с ионообменником. Если условия элюции тщательно подобраны, может быть достигнута высокая степень очистки. При работе с ДЭАЭ-целлюлозой используется сходная процедура с той лишь разницей, естественно, что адсорбцию проводят при рН 8 и в среде с 10 мМ фосфата или хлорида; градиентную элюцию осуществляют при постепенном снижении рН до 5 и увеличении концентрации хлорида до 500 мМ или фосфата до 200 мМ; это часто обеспечивает подходящие начальные условия для разделения.

Данные об иоиообменниках на целлюлозной основе приведены в обзоре [3656]. Для градиентной элюции целесообразно использовать буферные системы, в которых противоион (т. е. ион с зарядом, противоположным заряду эффективного иона) представлен одной формой (чтобы избежать образования в элю-ирующем буфере цвиттерионов), употреблять короткие колонки и наносить на колонку растворы белка с относительно низкой концентрацией. Ионообмениики могут быть также использованы для хроматографии белков в условиях определенных конечных коэффициентов распределения (равновесная хроматография). В настоящее время ее используют главным образом при работе с относительно небольшими белками, не применяя ступенчатую или градиентную элюцию. Этот метод является в ряде случаев очень эффективным, так как для разделения веществ достаточны очень небольшие различия в свободной энергии адсорбции (~0,25 Ккал/моль) [1104].

Повышения избирательности при ионообменной хроматографии можно достигнуть с помощью приема, который называют элюцией субстратом. В простейшем виде этот прием состоит в том, что фермент вносят в колонку в условиях, при которых его связь с ионообменником весьма слабая; при добавлении специфического субстрата, аналога субстрата или ингибитора нейтрализация заряженных групп фермента позволяет осуществить его избирательное элюирование с колонки. Поскольку вещество, являющееся субстратом, естественно, подвергнется на колонке превращению под действием фермента, целесообразно для специфической элюции использовать один из субстратов в случае двухсубстратной реакции или же аналог субстрата [5249].

Специфичность фермента можно также использовать в хроматографии не на стадии элюции, а на стадии связывания. При аффинной хроматографии, применяемой для фракционирования ферментов, используют лиганд (субстрат, аналог субстрата, ингибитор или эффектор), иммобилизованный на нерастворимом носителе. Такой сорбент избирательно связывает фермент из раствора, пропускаемого через колонку. Элюируют фермент различными способами, приводящими к диссоциации комплек-

5-2277 Глава 3

са фермент — лиганд. Выбор носителя, лиганда и условий элюции зависит от фермента. Чаще других веществ в качестве носителя используют агарозу, но кроме агарозы для этой цели применяют также полиакриламидные гели и стеклянные шарики. Лиганд должен быть соединен с носителем таким образом, чтобы не была нарушена его способность взаимодействовать с ферментом. Для того чтобы элюировать вещество с колонки, часто бывает достаточно изменить рН среды или включить в состав элюирующего раствора растворимый лиганд, который будет конкурентно вытеснять фермент из его комплекса с присоединенным к носителю лигандом. Недавно были опубликованы обзоры по аффинной хроматографии [924, 1315]. О'Карра и Бэрри укавывают, что для некоторых полисубстратных ферментов с успехом может быть использована своеобразная «негативная» элюция. Так, лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) задерживается на колонке с сефарозой с оксаматом (аналогом второго субстрата, пирувата) в качестве лиганда только в том случае, если в состав элюирующей жидкости введен NADH (первый субстрат). Если затем NADH исключают из раствора, то лактатдегидроге-наза элюируется с колонки. С помощью указанного приема из экстракта плаценты удалось получить почти чистый фермент за один этап выделения [3497].

Смесь белков можно разделить по их молекулярным размерам методом гель-фильтрационной хроматографии. В этом методе используются колонки из гелей поперечно сшитого декст-рана, гранулированного полиакриламида или агарозных гелей в виде шариков, которые выполняют роль «молекулярных сит». В колонке из пористых гранул часть раствора занимает пространство между гранулами, а часть находится внутри пор гранул. Гель-фильграция—одна из форм распределительной хроматографии, при которой растворенное вещество (фермент) распределяется между более подвижной (наружной) и менее подвижной (внутренней) частями раствора. Степень удержания растворенного вещества на колонке зависит от эффективности его проникновения в поры геля. Таким образом макромолекулы обычно выходят из колонки в порядке убывания их молекулярных размеров.

Декстраны, выпускаемые в виде сефадексов (более восьми типов), позволяют фракционировать белки по размеру молекул в области молекулярных масс примерно до 250 000; в этой же области молекулярных масс функционируют и гранулированные полиакриламидные гели, 10 типов которых поступает в продажу под названием биогель. Гранулированные агаровые гели, выпускаемые рядом фирм, позволяют фракционировать белки с молекулярными массами в пределах 50 000—40 000 000.

Теоретические основы гель-фильтрации пока еще мало разработаны, однако поведение растворенного вещества, по-види-

Выделение ферментов мому, зависит в первую очередь от его стоксова радиуса. Молекулы, имеющие приблизительно сферическую форму, разделяются в соответствии с теорией, в то время как поведение асимметричных молекул значительно о