уре останутся неразделенными.

Наиболее эффективное разделение компонентов смеси достигается методом электрофореза. Так, при анализе сложной смеси белков (например, мышечного экстракта) методом электрофореза со свободной границей или зональным электрофорезом наблюдают обычно большее число компонентов, чем с помощью метода ультрацентрифугирования или гель-фильтрации. Если очищенный препарат дает только один пик в аппарате Тизелиу-са, то это можно считать неплохим доказательством его чистоты. Однако известно, что при электрофорезе смеси двух белков может наблюдаться один пик, если проводить опыт только при одном значении рН; поэтому, для того чтобы получить убедительные результаты, необходимо провести электрофорез при нескольких значениях рН. Для установления гомогенности препарата обычно используют зональный электрофорез; при этом разделяются даже белки, мало отличающиеся друг от друга свободным зарядом, особенно если разделение проводить при рН, близком к изоэлектрической точке рассматриваемого фермента. После проведения зонального электрофореза поддерживающую Глава 3

среду обычно разделяют на две идентичные (или зеркальные) половины: одну половину окрашивают с целью обнаружения белка, а в другой определяют активность фермента. Если наблюдается только одна зона активности фермента, совпадающая с одной из белковых зон, то все другие не обладающие ферментативной активностью белковые зоны, следовательно, соответствуют примесям. Однако все чаще обнаруживают, что однотипной ферментативной активностью могут обладать два или даже больше видов белковых молекул. Выявляемые различные формы фермента [2167] часто очень близки по свойствам (гл. 12) и могут быть разделены с помощью более чувствительных приемов, например таких, которые обычно используют для определения гомогенности препаратов. Существование таких форм фермента (часто называемых изоферментами, или изозимами) значительно осложняет оценку чистоты препарата, и экспериментатор прежде всего должен решать, исследовать ли все семейство молекул, обладающих одинаковой ферментативной активностью, или ограничиться изучением молекул одного типа. Когда изоформы одного фермента имеют разные удельные активности, может казаться, что одна форма «чище», чем другая*

Изоэлектрическое фокусирование является очень мощным аналитическим методом благодаря тому, что с его помощью можно различать белки, изоэлектрические точки которых отличаются всего на 0,01 единицы рН. В отличие от других методов разделения в этом методе белковые зоны в течение опыта делаются более узкими, а не расширяются за счет диффузии. Если белки не окрашены и, следовательно, их нельзя обнаружить визуально, локализацию компонентов после изоэлектрического фокусирования устанавливают элюцией и определением белка в пробах (в случае стабилизированного жидкого градиента) или специфическим окрашиванием (в случае когда поддерживающей Средой является гель). Изоэлектрическое фокусирование является одним из наиболее чувствительных методов определения гомогенности; в то же время этот метод позволяет обнаружить существование различных форм одного фермента. В ряде случаев ферменты, юмогенность которых была установлена по всем другим критериям, при изоэлектрическом фокусировании были разделены на несколько компонентов. Поэтому иногда предполагают, что сам метод ответствен за возникновение гетерогенности, которую он отражает.

Следует отметить, что ни один из до сих пор описанных методов, хотя все они достаточно чувствительны, не позволяет определить присутствие примесей, находящихся в растворе в очень малых количествах, так как обычно они составляют менее 1% общего количества анализируемого белка. Для определения чистоты белка может быть использован также метод по-

Рис. 3 2. Определение чистоты фермента по кривой растворимости.

Количество добавленного белка

строения кривых растворимости [3473]. Он заключается в том, что в серии проб определенный постоянный объем растворителя (вода или солевой раствор) взбалтывают с различными количествами фермента, после чего пробы фильтруют или центрифугируют и в полученных растворах определяют количество белка. Затем строят график, как показано на рис. 3.2,Л, откладывая nq оси ординат найденное, а по оси абсцисс взятое количество белка. В первых пробах серии весь добавленный белок растворяется, и количество его в растворе равно количеству добавленного белка, так что график представляет собой прямую, у которой тангенс угла наклона равен 1. Затем достигается насыщение. После этого (если мы имеем дело с чистым белком), сколько бы белка мы ни добавляли, количество его в растворе увеличиваться не будет, так что начиная с момента насыщения, график становится горизонтальным. Однако если в пробе присугствует второй белок, то после того, как будет достигнута точка насыщения для менее растворимого белка; второй белок все еще будет растворяться; так будет продолжаться до тех пор, пока и для него не будет достигнута точка насыщения, и лишь после этого график пойдет параллельно оси абсцисс. Поэтому первая часть графика в этом случае будет представлять собой ломаную линию (рис. 3.2,5), причем наклон первого ее отрезка будет больше наклона второго (вследствие того, что второй компонент составляет лишь часть Глава 3 /

общего количества белка). И действительно, прямолинейные отрезки соответствуют каждому из' двух присутствующих компонентов.

Более простой способ определения чистоты фермента предложил Нортроп. По этому способу определяют на графике только две точки, а именно точку, в которой происходит первый перелом, и точку со значительно большей абсциссой. Для определения берут две пробирки с растворителем; к первой добавляют такое количество белка, которого как раз достаточно, чтобы дать очень слабое помутнение, ко второй — в 10 раз большее количество, после чего обе пробирки центрифугируют. Если в обеих надосадочных жидкостях обнаружится совершенно одинаковое количество белка, то ясно, что график будет иметь форму, показанную на рис. 3.2,Л; если же в надосадочиой жидкости второй пробирки количество белка будет большим, то это свидетельствует о том, что препарат содержит более чем один компонент.

Однако данный метод используется реже, чем чувствительные методы электрофореза, поскольку для построения кривых растворимости требуются довольно большие количества белка в соответствующей форме.

ЗАТРУДНЕНИЯ, ВСТРЕЧАЮЩИЕСЯ ПРИ РАБОТЕ С ЧИСТЫМИ ФЕРМЕНТАМИ

Благодаря существующей теперь возможности получать ферменты в чистом виде мы можем использовать в эксперименте относительно большие их количества. Обычно количество фермента, необходимое для определения его активности, выражается величиной порядка 1 мкг. В настоящее время имеется возможность вносить в опытную пробу до 10 мг фермента, но это таит в себе и некоторую опасность.

Для изучения специфичности желательно работать с чистыми ферментами, однако не следует брать их в слишком больших количествах, ибо если в этих случаях наряду с основной обнаруживается иная дополнительная катализируемая реакция, то возникает подозрение, что она обусловлена другим ферментом, присутствующим в небольшом количестве как примесь. Особенно важно это в связи с тем, что примеси, составляющие менее 1%, обнаружить очень трудно, о чем уже упоминалось выше. Если для опыта был взят всего 1 мг фермента, то это означает, что в пробе может присутствовать 10 мкг сопутствующего фермента, а такое количество значительно превосходит то, которое обычно необходимо, чтобы эффективно катализировать ферментативную реакцию. Опасность уменьшается, если фермент много раз перекристаллизован, но она все же остается, если в опыте используют большие количества фермента.

Выделение ферментов_81

При изучении двуферментной системы в тех случаях, когда один из ферментов добавляется в большом избытке, имеется опасность другого рода. Если два фермента обладают общим коферментом или носителем, к которому один из изучаемых ферментов имеет большое сродство, то этот фермент может связать практически весь присутствующий кофермент, так что второй фермент будет его совершенно лишен. Так, Штрауб [4527] показал, что в лактатдегидрогеназной системе (КФ 1.1.1.27) реакция вообще не будет протекать, если в систему добавить большое количество фермента (рис. 4.7)!

С 007/

V

Глава 4

Кинетика действия ферментов

ЗНАЧЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Характерным свойством ферментов является нх способность катализировать определенные химические реакции. При изучении каталитической активности ферментов необходимо основываться на количественной оценке скоростей катализируемых реакций. Изучение влияния различных факторов на скорость данной реакции дает возможность делать выводы о механизме действия фермента. В идеальном случае данные кинетических исследований следует сопоставлять с данными, полученными при изучении химии н структуры фермента, чтобы получить более глубокую характеристику изучаемого процесса. Однако это возможно только тогда, когда соответствующий ф