да ясно существенное различие между Ks и Км- Обе ¦величины характеризуют концентрацию активного комплекса

Кинетика действия ферментов (х), используя б и s, но в первом случае имеются в виду равновесные, а во втором реальные концентрации, имеющие место в ходе катализа.

Очевидно, что в случае обсуждаемой реакции изменения начальной скорости в зависимости от концентрации субстрата будут одинаковыми для стационарного и равновесного режимов. Для двух крайних случаев имеем: если s велико, v—V,

если же s мало, v=~s, т. е. vocs.

As

Хотя допущения, сделанные при выводе уравнения Михаэлиса, приводят к результату, который удовлетворяет экспериментальным данным, это еще не доказывает их правильности, ибо к тем же результатам приводят и многие другие допущения; в частности, можно указать на такие механизмы, как адсорбция в соответствии с изотермой Ленгмюра [2698] и цепные реакции.

Однако, каково бы ни было его теоретическое истолкование, уравнение Михаэлиса — Ментен справедливо в подавляющем большинстве случаев. Во всех этих случаях изменение скорости реакции при изменении концентрации субстрата носит одинаковый характер, а именно — оно зависит от отношения концентрации субстрата к константе Михаэлиса. Если для удобства назвать эту последнюю величину относительной концентрацией субстрата, обозначив ее через а:

(4-20)

и, кроме того, ввести понятие относительной скорости

q>=-f, (4.21)

то уравнение Михаэлиса можно записать в виде

Ф-ТТГ- (4-22)

При графическом изображении последнего уравнения получают приведенные на рис. 4.11 нормированные кривые, которые могут быть применены для анализа действия любого фермента.

Из уравнения (4.22) следует, что если концентрация субстрата высока, то <р = 1, если же она очень мала, то ф = а.

График зависимости скорости от концентрации субстрата для данного фермента определяется двумя величинами, а именно V и Км- В простых равновесных условиях Км (в данном случае она принимается равной Ks) является константой равновесия реакции диссоциации (4.5), а V представляет собой меру константы скорости распада фермент-субстратного комплекса {уравнение (4.6)]. В этих условиях Кж является величиной, обГлава 4

j

ратной сродству фермента к субстрату. Однако это простое соотношение не выполняется, когда система стационарна, поэтому не следует судить о сродстве по величине Км до тех пор, пока не будет убедительно показано, что выполняются равновесные условия. Отметим, однако, что V является мерой константы скорости распада фермент-субстратного комплекса как в стационарных, так и в равновесных условиях. Те или иные факторы могут изменять начальную скорость, влияя либо на стадию образования фермент-субстратного комплекса, либо на стадию распада этого комплекса, либо на обе эти стадии; изучение влияния таких факторов на Км и V позволяет в известной мере дифференцировать эти влияния.

Определение V и Кы

Для определения УиКм поданным ряда измерений скорости при различных концентрациях субстрата график уравнения Михаэлиса (4.11) может быть построен несколькими путями.

1. Если построить график зависимости v от s, как это сделано на рис. 4.12,Л, то полученная кривая будет представлять собой отрезок равнобочной гиперболы. При замене v на V/2 получаем s = Km, и величина Км будет равна абсциссе «средней» точки экспериментальной кривой. Разные ферменты характеризуются, естественно, разными кривыми в зависимости от V и Км.

Рис. 4.12. А—Е. Шесть способов графического определения величин Км. и V по влиянию концентрации субстрата на скорость реакции. Глава 4

2. Второй метод графического изображения представлен на рис. 4.12, Б, на котором приведена зависимость v от pS( = —lgs); кривая имеет такую же форму, какая обычно наблюдается при процессах диссоциации. Этот метод изображения соответствует логарифмической форме уравнения Михаэлиса

p5=pKM+lg-^-. (4.23)

В данном случае изменение величины Км не влияет на форму кривой, которая зависит только от последнего члена уравнения, а просто смещает кривую вдоль горизонтальной оси вследствие изменения рЛм (=—Ig/См). Если принять v равным V/2, то последний член становится равным нулю, а величина р5 в средней точке кривой — равной рЛм. На практике главная трудность при определении Км по какой-либо из этих кривых заключается в получении экспериментальных точек при достаточно высокой концентрации субстрата, обеспечивающей достижение максимальной скорости.

3. Третий метод графического изображения, обычно приписываемый Лайнуиверу и Бэрку1 [2832], обходит упомянутое выше затруднение. Если построить график зависимости l/v от 1/s, как это представлено на рис. 4.12, В, т. е. воспользоваться методом двойных обратных величин, то он будет представлять собой прямую, описываемою уравнением

4—^-4+7- ИЛИ ^ = 1+^ (4-24)

и пересекающую ось абсцисс в точке —1/Ам. Это легко показать, если подставить 1/и = 0 в уравнение (4.24); в результате получаем

_1____1_

s ~ Км. '

Прямая пересекает ось ординат в точке 1/V и имеет наклон, равный Км/У-

4. Еще один метод, с помощью которого получают прямую, довольно близкую к той, какую дает предыдущий метод, состоит в построении графика зависимости sfv от s в соответствии с уравнением, полученным в результате умножения обеих частей уравнения (4.24) на s [1765]:

(4-25)

1 Этот метод графического изображения был предложен Вульфом [5160] (цит. Холдейном и Стерном в 1932 г., т. е. за 2 года до появления в печати работы Лайнуивера и Бэрка). Вульф также использовал длины отрезков, отсекаемых получаемой прямой от осей координат.

Кинетика действия ферментов В этом случае наклон прямой равен 1/V и она пересекает ось ординат в точке Km.IV, как это показано на рис. 4.12, Г. Величину — Км. получают путем продолжения прямой до пересечения с осью абсцисс.

5. Метод, предложенный Вульфом [5160] и усиленно поддержанный Хофсти [1991], иллюстрирует рис. 4,12, Д. В этом случае строят график зависимости v от v/s в соответствии с уравнением

v = V-K^, (4.26)

которое представляет собой другую форму записи уравнения (4.11). Величину Км получают путем деления длины отрезка, отсекаемого на оси ординат, на длину отрезка, отсекаемого на оси абсцисс.

Детальное сравнение линейных графиков трех типов было проведено Даудом и Риггсом [1147]; они исследовали влияние ошибок в определении начальных скоростей на получаемые значения Км и У и установили, что метод двойных обратных величин (3) является менее надежным. Выбор между двумя другими методами, 4 и 5, в известной степени зависит от характера ошибок при определении v, однако в.общем случае последний из них, по-видимому, несколько лучше — он более чувствителен к отклонению от линейности. Эти авторы отмечают, что надежность метода двойных обратных величин можно значительно повысить рациональным планированием экспериментов. Конечно, ни один из этих методов не позволяет получить столь точных результатов, как обсуждаемый ниже статистический метод, в котором анализируется.гиперболическая зависимость v—s; однако для обычных исследований, когда не требуется максимальная точность, метод двойных обратных величин оказывается вполне подходящим.

Поскольку в большинстве опубликованных работ данные по ферментативной кинетике проанализированы по методу 3, он и используется в основном в данной книге. Конечно, легко представить себе, как будет выглядеть график и для случая 4, поскольку, при этом фактически «меняются местами» наклоны и отсекаемые на осях отрезки.

6. Теория, на которой основаны рассмотренные выше методы, включает предположение о том, что концентрация фермента очень мала по сравнению с концентрацией субстрата; по оси откладывают концентрацию свободного субстрата s (на практике это полная концентрация добавленного субстрата St). Предположение о том, что s = st, не всегда, однако, выполняется. Метод, который не требует подобного допущения, был предложен М. Диксоном 1*1114] и представлен на рис. 4Л2.Е. Как и в случае А, строят график зависимости скорости отконцентГлава 4

рации субстрата и проводят горизонтальную прямую, соответствующую V (определенную, как обычно, при насыщающих концентрациях субстрата). На кривой отмечают точки, лежащие ниже уровня V, на расстояниях V/2, V/3, V/4, V/b и т. д. и проводят через них прямые от начала координат до пересечения с ^-прямой. Расстояния вдоль этой прямой от одной точки пересечения до другой соответствуют величине Км, выражаемой в тех же единицах, что и s. Если провести касательную к кривой в начале координат (соответствующую V/1 в рассматриваемой серии), то при этом также отсекается отрезок, равный Км, однако провести такую касательную достаточно точно может оказаться весьма затруднительно. Математическое обоснование метода приведено на с. 181—182.

Построение на рис. 4.12,? проведено для случая, когда s = st, однако преимущество данного метода заключается в том, что эта предпосылка не является необходимой; метод остается в равной мере применимым, если по оси отложено S