вечающий уравнению (4.86), — состоит во введении в систему, конкурентного ингибитора субстрата А. Если первичные графики двойных обратных величин параллельны вследствие того, что KSA очень мало, то кажущееся значение этой константы может увеличиться при проведении кинетических определений в условиях фиксированной концентрации конкурентного ингибитора. Если в этих условиях прямые пересекаются, это означает, что реакция протекает не по механизму двухстадийного переноса. В этом случае для установления механизма нельзя, однако, использовать продукт реакции, поскольку, как отмечалось выше, в случае двухстадийного переноса в присутствии продукта графики обратных величин пересекаются.

Другой путь выявления механизма двухстадийного переноса состоит в проведении измерений при постоянном отношении концентраций субстратов, так что b = za. В этом случае для механизма двухстадийного переноса уравнение, обратное (4.122), имеет вид

и, следовательно, график зависимости величины, обратной начальной скорости, от 1/а будет линейным. Для систем же, опи-

_Кинетика действия ферментов сываемых уравнением (4.86), выражение для зависимости обратных величин имеет вид

44*"a*^+J^)-tt+t: (4л24)

ему отвечает график, отклоняющийся от прямой вверх (парабола).

Для реакции, протекающей по механизму двухстадийного переноса, можно выделить два этапа; так, в случае схемы (4.121) при наличии первого субстрата (А), но в отсутствие второго (В) осуществляется реакция

Е + А ЕА 4=fc Е'Р ч=* Е' + Р, (4.125)

при этом на один активный центр фермента освобождается максимум одна молекула А; обнаружение такой реакции является убедительным свидетельством в пользу функционирования фермента по рассматриваемому механизму. Если реакция (4.125) идет до конца, то по количеству образовавшегося продукта можно рассчитать молекулярную массу, приходящуюся на активный центр фермента, что и было сделано в случае ами-ноксидазы (флавинсодержащей) (КФ 1.4.3.4) [4748].

Однако данные рассмотренного типа сами по себе еще ие доказывают, что имеет место механизм двухстадийного переноса, так как в случае другого механизма может происходить «утечка» интермедиата в отсутствие второго субстрата. Например, в реакции переноса, протекающей по механизму Теорел-ла — Чаиса

в

Е 4=fc ЕАХ я—*- ЕХА ч—>> ЕХВ <—» ЕВХ <—>¦ Е, (4.126)

освобождение А может происходить до связывания В, т. е. возможен второстепенный путь

ЕХА 4=* EX «=fc ЕХВ. (4.127)

Если, однако, освобождение А происходит значительно медленнее, чем превращение

ЕХА ^JLt ЕХВ, (4.128)

то при всех обычных концентрациях В концентрация ЕХ будет пренебрежимо малой. В таком случае можно обнаружить образование А в отсутствие В, даже если процесс двухстадийного переноса не протекает в сколько-нибудь значительной степени; именно такая ситуация обсуждалась в связи с механизмом действия 6-фосфофруктокиназы (КФ 2.7.1.11) [2083]. Следовательно, для того, чтобы использовать в качестве доказательства на-

Таблица 4.3

Кинетические константы двухсубстратных систем, выраженные через константы скорости.

Все приведенные инже системы подчиняются общему уравнению (4.86)"

Кинетический механизм *к Kf V

Неупорядоченный механизм, *.« k-a ke

равновесные условия [схема (4.96) и рис. 4.20] Упорядоченный механизм, равновесные условия [схема (4.116)] Упорядоченный механизм, ста- 0 k+i k.t k+3 k+be

k+ffc+*k+3 k+1 k-t k+% fe+5 (k-2k-3 + A_2fe+4 + k+3k+i) k+bk+lk+3e

ционарные условия, образование двух тройных комплексов [схема (4.114)] Упорядоченный механизм, ста- k+J ?+3^+4 k-i k+*T k+i (k-2 + k+3) T k+ ik+3e

ционарные условия, образование одного тройного комплекса [схема (4.116)] Упорядоченный механизм, стационарные условия; А действует как активатор, оставаясь связанным с ферментом [схема (4.119)] Механизм Теорелла—Чанса k+1 (6+4 + &+з) 0 k+1 k-i k+i [k+i + k+3) k-%k-3 -f- 6-2^+4 + ?+3^+4 k+3 + ?+4 k+ik+3e

k+з k+1 k-i k+2 (k-a + k+i + k+3) k+3 k-3 +^+4+^+3 k+3e

[схема (4.120)] Двухстаднйный перенос [схе- k+5k+a (k+Jl+3 + +fc-ifc_2) k+1 0 k+2 k+ik+s (k-ik-b + k+bk+t + k-tk+s) k+Jt+sfc+bk+tn

ма (4.121)] k+iU и

T => fe+5fe-3 + fe+5&+» + k+ik+з + k+ik+з ,

U =* fe(.3%f-Jfe+3 +k+bk?bk^ -(- k^k +5fe+e -f- k+2k+3k-s + k+ik+3k+b + k+2k+3k+t

" Во всех линейных последовательностях константы скорости пронумерованы по очередности стадий; положительные номера относятся к прямому направлению реакции, а отрицательные — к обратному [см., например, уравнения (4.33) и (4.90)].

\

_Кинетика действия ферментов линия двухстадийного переноса тот факт, что можно обнаружить образование продукта в отсутствие одного из субстратов, необходимо в идеальном варианте показать, что освобождение продукта происходит достаточно быстро, чтобы оно могло быть» обязательной стадией полной реакции.

б. Исследование ингибирования продуктом

Нередко удается сделать выбор между возможными кинетическими механизмами двухсубстратных реакций путем определения типа ингибирования, вызываемого продуктом реакции (см., например, [803, 1452, 4750]). Различные типы обратимого ингибирования и соответствующие механизмы обсуждаются подробно в гл. 8. Здесь же достаточно отметить, что они классифицируются по характеру графиков двойных обратных величин (в присутствии ингибиторов), а не по какому-либо специфическому механизму, лежащему в основе эффекта. Так, графики? зависимости l/v от l/s при ряде фиксированных концентраций? ингибитора характеризуются определенными признаками, перечисленными в табл. 4.4.

Для того чтобы понять, как с помощью данных о характере ингибирования продуктом можно установить кинетический механизм, необходимо рассмотреть влияние изменения отдельных кинетических констант, входящих в уравнение (4.86), на вид графиков двойных обратных величин. Рассмотрим два возможных случая:

а) концентрация фиксированного субстрата является величиной того же порядка, что и Км для этого субстрата (ненасыщающая концентрация); б) эта концентрация столь высока, что» соответствующие члены уравнения становятся несущественным» (например, в случае фиксированного субстрата В членами:

Таблица 4.Ф

Особенности графиков зависимости двойных обратных величии при наличии ингибирования различного типа

Ингибироваиие

Особенности графиков зависимости двойных обратных величин при нескольких концентрациях ингибитора

Конкурентное

Прямые пересекаются в точке, лежащей на оси 1/у

Неконкурентное

Прямые пересекаются в точке, лежащей на оси —l/s

Бесконкурентное Смешанное

Прямые параллельны

Прямые пересекаются либо выше, либо ниже-оси —l/s

10-2277 Глава 4

X ± а ненасыщающая J, а насыщающая h

Рис 4 25 Графики зависимости двойных обратных величии, соответствующие уравнению (4 86), при насыщающих и ненасыщающих концентрациях фиксированного субстрата.

KsAKiAB/cib и Км.в/Ь можно пренебречь); в этих условиях концентрация субстрата В считается насыщающей.

Вид уравнения двойных обратных величин для этих двух частных случаев обсуждался на с. 129 [уравнения (4.87) — (4.89)], а соответствующие графики приведены на рис. 4.25. Тип ингибирования, вызываемого продуктом, можно предсказать, рассмотрев характер изменения констант, входящих в уравнение (4.86). Если влияние ингибитора проявляется в увеличении одной или нескольких констант, которые входят в состав члена, определяющего наклон прямой (рис. 4.25), а константы, от которых зависит длина отрезка, отсекаемого от оси l/v, при этом не изменяются, то имеет место конкурентное ингибирование. В случае когда ингибитор «изменяет» оба типа констант, ингибирование является смешанным или неконкурентным. Наконец, если в присутствии ингибитора изменяются константы, определяющие длину отрезка, который отсекается от оси \/v, и остаются неизменными константы, от которых зависит наклон,

Кинетика действия ферментов наблюдается бесконкурентное ингибироваиие. Эти выводы суммированы в табл. 4.5 с использованием констант, входящих ш уравнение (4.86).

В табл. 4.5 рассмотрены не все возможные случаи, а лишь те, которые обычно встречаются при анализе функционирования ферментных систем; другие варианты ингибирования (например, увеличение KsA, КмА и Кмв) легко получить из данных рис. 4.25 и уравнения (4.86).

Остановимся теперь на возможных путях влияния ингибитора на кинетические константы (см. табл. 4.5).

а. Если ингибитор связывается с тем же ферментным интер-медиатом и в том же участке, что и субстрат А, не препятствуя связыванию субстрата В, то в присутствии ингибитора увеличивается концентрация А, необходимая для полунасыщения фермента, и, следовательно, обычно увелиичваются КмА и Ksa (см. также гл. 8). Это соответствует варианту ингибирования (а) в табл. 4.5.

б. Этот случай будет подробно рассмотрен в разделе о равновесных неупорядоченных с