Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

иализа тем, что фермент и субстрат растворяют в одном растворе, и с помощью ультрамембраны отделяют от белоксодержащей фазы небольшое количество безбелковой фазы. Определяют концентрацию субстрата в ультрафильтрате и полагают, что она равна концентрации несвязанного субстрата в присутствии фермента. Альтернативный метод заключается в том, что весь раствор субстрата продавливают через ультрамембрану, а затем определяют количество субстрата, связанного с ферментом, который задержан на мембране. Во всех этих методах можно использовать устройства, позволяющие проводить одновременно несколько опытов.

Коловик и Вомак [848] предложили метод равновесного диализа, который позволяет не дожидаться установления равновесия; он основан на том, что стационарная скорость прохождения через мембрану диффундирующего субстрата пропорциональна разности концентраций свободного субстрата по обе

Кинетика действия ферментов

ПТ

стороны мембраны. При этом определяют стационарную концентрацию субстрата в буферном растворе, проходящем через-диализную мембрану. Измерения занимают значительно меньше времени, чем при обычном методе равновесного диализа.

Хуммель и Дрейер [2085] разработали способ определения-количества связанного субстрата методом гель-фильтрации. Метод основан на том, что низкомолекулярный субстрат движется через колонку с соответствующим гелем — молекулярным-ситом — медленнее, чем высокомолекулярный фермент. Если колонка уравновешена раствором субстрата, фермент будет выходить из нее вместе со связанным субстратом (пик на рис. 4.29), а далее на хроматограмме будет наблюдаться впадина из-за связывания соответствующего количества субстрата проходящим ферментом. Если при прохождении фермента через-, колонку достигается равновесие, то площадь пика, отвечающего, связанному субстрату, будет равна площади впадины; следовательно, в том случае, когда трудно определить количество связанного субстрата, его можно установить по площади впадины. Был также предложен аналогичный метод определения количества связанного субстрата с помощью ультрацентрифугирования [1869 а].

Наряду с прямыми методами для исследования связывания субстрата в ряде случаев можно использовать методы, основанные на регистрации изменения свойств либо субстрата, либо фермента (при связывании субстрата). Так, было показано, что

Рис. 4 29 Определение связывания радиоактивного AMP с фруктозобисфосфа* тазой (КФ 3 1311) с помощью гель-фнльтрации на сефадексе G-25 [3248]. Колонка уравновешена при 30 °С 10 мкМ АТР [4000 имп/(мин-нмоль)] при рН 7,2. Через колонку пропускали 0,5 мл раствора фермента (2,9 мг/мл). О радиоактивность, ф поглощение при 260 нм, Щ поглощение при 280 нм,

12—9977 Глава 4

спектр поглощения NAD изменяется при связывании с глице-ральдегидфосфатдегидрогеназой (КФ 1.2.1.12) [3797]; при связывании с некоторыми дегидрогеназами изменяется флуоресценция NADH (см., например, [516]). Аналогичным образом за связыванием субстрата можно следить по изменению таких свойств фермента, как флуоресценция [4836] или дисперсия оптического вращения [4751]. В случае ферментов, имеющих два или больше субстратсвязывающих участков, необходимо быть уверенным, что изменение данного показателя пропорционально степени насыщения в расчете на все связывающие участки, поскольку такое соотношение может не всегда выполняться {1994].

При использовании для определения связывания прямых методов необходимо остановить реакцию на стадии образования фермент-субстратного комплекса. Следовательно, односуб-стратную реакцию типа (4.13) таким простым способом изучать нельзя; в этом случае, однако, можно использовать нереакци-•онноспособный конкурентный ингибитор. Для двухсубстратных же реакций можно изучать связывание того или иного субстрата в зависимости от механизма реакции. Так, если фермент функционирует по неупорядоченному механизму (рис. 4.20), ¦можно изучать связывание любого из субстратов в отсутствие другого, в то время как в случае упорядоченного механизма, например типа (4.114) или (4.120), связывание А можно исследовать в отсутствие В, однако В не будет связываться в отсутствие А, если только не образуется тупиковый комплекс. Ферменты, катализирующие двухстадийный перенос, нельзя исследовать этим простым" методом, поскольку фермент способен реагировать с одним субстратом в отсутствие другого.

Для системы типа (4.191) в предположении, что концентрация фермента значительно меньше s, можно записать

Ks={e~X)s , (4.192)

где х — концентрация комплекса ES, a s и е — концентрации свободных фермента и субстрата соответственно. После преобразования получим

(4.193)

Это уравнение имеет такой же вид, как и обычное уравнение Михаэлиса (4.18), и указывает на гиперболическую зависимость ¦х от 5. Проведя определения связывания S при ряде концент-

Кинетика действия ферментов

П9>

раций, можно, следовательно, рассчитать Ks, используя обратную форму этого уравнения:

-1-f—L. (4.194)

х е s ' е 4 '

Некоторые ферменты имеют более чем один участок связывания; разработаны графические методы определения числа* участков связывания, а также Ks- Удобно определить число молекул субстрата, связываемых одной молекулой фермента, как

r=-f. (4.195>

Если молекула фермента имеет более чем один участок связывания (например, п), необходимо оперировать концентрацией таких участков {tie), а не концентрацией фермента (е); подставляя пе вместо е и ег вместо х в уравнение (4.192), получаем

r=n—r^f-. (4.196)

Следовательно, график зависимости г от r[s будет прямой с наклоном —Ks, которая пересекает оси ординат и абсцисс в точках п и n/Ks соответственно. Можно использовать также график зависимости 1/г от l/s:

— =-?*.-! +-L. (4.197V

г п s ' п 4 '

График этой функции является прямой с наклоном Ks/ti, пересекающей ось ординат в точке 1/п, а ось абсцисс — в точке l/Ks-

Уравнение (4.196) используется чаще других; соответствующий график часто называют графиком Скэтчарда (см. [4010]). На рис. 4.30 приведен такой график для связывания а-нафтил-пропионата (конкурентный ингибитор) химотрипсином.

Для фермента, содержащего участки связывания с разным сродством, уравнение (4.193) несколько усложняется. Например, для фермента, содержащего два вида участков, 1 и 2, различающихся сродством к субстрату, имеем

г=г,+г2= \ (4.198)

Это уравнение нельзя упростить так, чтобы оно имело вид простой линейной функции; график Скэтчарда для этой системы не будет линейным (см. рис. 4.31). Аналогичное уравнение получается и для системы двух ферментов с различным сродством к субстрату. Как обсуждалось на с. 118—121, экстраполяция ли-

12* Глава 4

¦0,5

о

Рис. 4.30. Связывание а-нафтил-пропионата с а-химотрипсином [2855]. [I]—концентрация свободного а-нафтилпропионата: / и // — теоретические прямые для я=1 и п—2 соответственно, /С«= 100 300 500

=4-Ю-3 М.

г/т

яейных участков графиков, аналогичных приведенному на рис. 4.31, в общем случае не позволяет достаточно надежно определить константы диссоциации и число участков связывания.

Следует помнить, что при всех методах определения констант связывания путем измерения концентрации ES, независимо от того, какой подход при этом используется — определение скоростей реакций, спектроскопические или какие-либо другие физические методы — получаемые константы будут равны Км, если они определяются для реально протекающей реакции, и Ks, если реакция не протекает. Как отмечалось выше, Ks является константой равновесия, позволяющей связать равновесное значение х с е и s, в то время как Км — это «псевдоравновесная константа», связывающая реальное значение х с е и s в условиях протекания реакции. Чтобы определить Ks одним из рассмотренных выше методов, необходимо, следовательно, создать условия, при которых реакция не идет. Для этого, например, можно ввести в реакционную смесь только один из двух субстратов в случае двухсубстратной реакции, не вводить необходимый для протекания реакции активатор, создать условия, при которых активность фермента мала (например, при рН, далеком от оптимума), использовать вместо субстрата конкурентный ингибитор, который не подвергается превращению (в этом случае определяемая константа будет равна Ki), или воспользоваться каким-либо другим методом.

При исследовании связывания, как нередко и в кинетических исследованиях, не всегда можно считать, что молярная концентрация фермента мала по сравнению с концентрацией субстрата. Так, при изучении очень медленных реакций может оказаться необходимым использовать относительно большие

Кинетика действия ферментов

i Рис. 4.31. Связывание СТР с ас-партат — карбамоилтрансферазой (КФ 2.1.3.2) [5120]. Эти данные согласуются с предположением о наличии у фермента примерно трех высокоаффинных связывающих участков для СТР (К*=1 мкМ) и примерно трех участков с меньшим сродством (A"s=210 мкМ).

г/[СТР]

концентрации фермента, и если при этом сродство фермента к субстрату очень ве

страница 40
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(20.11.2019)