Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

с ферментами, активность которых зависит от активатора, как в только что рассмотренном примере, следует учитывать вероятность того, что субстрат будет конкурировать с активатором за взаимодействие с ферментом и, следовательно, при высоких концентрациях субстрата будет наблюдаться ингибирование [500].

Рис. 4.41. График зависимости скорости редкции от концентрации субстрата (построенный по методу Лайнуивера — Бэрка) для действия неорганической пирофосфата-зы (КФ 3.6.1.1) в условиях постоянной величины отношения молярных концентраций MgCl2/ /Na2P207=3,8 [464].

Кинетика действия ферментов 5. К значительному ингибированию в условиях высокой концентрации субстрата может привести присутствие в субстратах примеси, действующей как смешанный или бесконкурентный ингибитор [804, 2061]. Эти эффекты более подробно обсуждаются в гл. 8.

<5. Ингибирование высокими концентрациями субстрата в двухсубстратных реакциях

Ингибирование избытком субстрата в этих реакциях может проявляться таким же образом, как в односубстратных реакциях, и график зависимости l/v от обратной концентрации ин-гибирующего субстрата имеет такую же форму, как и в простом случае для односубстратной реакции. Однако для двухсубстратных реакций принято строить графики двойных обратных величин при изменяющейся концентрации одного субстрата и ряде фиксированных концентраций второго субстрата, и ингибирование при высоких концентрациях этого второго субстрата может проявляться в изменении характерного вида этих графиков.

Дальциль [956] проанализировал несколько возможных типов ингибирования субстратом и показал, что, как и в случае простого ингибирования, их можно разделить на конкурентное, бесконкурентное и смешанное ингибирование (см. гл. 8). Если при высокой концентрации второго субстрата наблюдается конкурентное ингибирование, то у графиков двойных обратных величин изменяется только наклон; если ингибирование бесконкурентное, то изменяется только длина отрезков, отсекаемых от оси l/v; при смешанном ингибировании изменяются и наклоны, и длины отрезков. Наряду с такими простыми может встретиться случай «частичного» ингибирования высокой концентрацией субстрата, при котором в результате связывания ингибирующе-го субстрата начинает функционировать менее эффективный альтернативный путь реакции (см. гл. 8). При частичном субстратном ингибировании вторичные графики зависимости наклонов или длин отрезков (получаемых из графиков двойных обратных величин при высокой концентрации ингибирующего второго субстрата) от концентрации второго субстрата не являются линейными.

I. Конкурентное ингибирование высокими концентрациями субстрата. Оно наблюдается в случае, когда связывание ингибирующего субстрата препятствует связыванию другого субстрата. Так, в случае двухсубстратной реакции

A+B,=fcP+Q (4.217)

связывание с ферментом второй молекулы В препятствует связыванию А. Для того чтобы при этом ингибирование было кон-

13-2277 Глава 4

курентным, ингибирующая молекула В должна связываться с той же формой фермента и с тем же участком, что и молекула А. Дальциль [956] рассмотрел ингибирование высокими концентрациями субстрата при упорядоченном механизме. Для системы

ЕВ

ЕА

ЕАВ

EPQ

EQ

Е (4.218)

связывание молекулы субстрата В со свободным ферментом рассматривается как конкурирующее со связыванием субстрата А. Уравнение скорости в стационарных условиях для этой системы или для системы, у которой концентрацией тройных комплексов можно пренебречь (например, в случае механизма Теорелла— Чанса), имеет вид

t>=-

V

1 +

1 + Ж

• +

ab

(4.219)

Оно сходно с уравнением для упорядоченной системы в присутствии ингибитора, конкурентного по отношению к А; отличие состоит в том, что в рассматриваемом случае ингибитор является одним из субстратов. Следует отметить, что при относительно небольшой концентрации В (b/Ki^l) это уравнение упрощается до (4.86), и, следовательно, графики двойных обратных величин будут такими же, как для системы (4.86). При высоких концентрациях В графики зависимости l/v от 1/Ь будут отклоняться вверх, что характерно для ингибирования высокими концентрациями субстрата. Графики в координатах {1/а; l/v} линейны при всех концентрациях В, однако их наклоны не являются линейной функцией 1/Ь. Таким образом, при низких концентрациях В графики пересекаются в одной точке слева от оси l/v; при высоких концентрациях В этого не наблюдается (рис. 4.42,Л).

Конкурентное ингибирование высокими концентрациями субстрата обычно имеет место в системах с двухстадийным переносом. Например, в случае системы (4.121) при не слишком различающихся Е и Е' субстрат, связывающийся с Е, будет, скорее всего, связываться в какой-то степени также с Е', Следовательно, при высоких концентрациях субстрат А окажется ингибитором реакции, поскольку он будет связываться не только с Е, но и с Е'. Таким образом, при высоких концентрациях А будет выступать в роли конкурентного ингибитора связыва-

Кинетика действия ферментов ния В с ферментом. Если ингибирование является истинно конкурентным, то при насыщающих концентрациях В оно не будет наблюдаться; следовательно, длины отрезков, отсекаемых от оси l/v графиками зависимости l/v от 1/Ь (это соответствует области насыщающей концентрации В) при разных ингибирую-щих концентрациях А будут одинаковыми. В то же время наклон этих графиков будет увеличиваться при высоких концентрациях А, и, следовательно, образуется семейство кривых, параллельных при низких концентрациях А и расходящихся при более высоких концентрациях этого субстрата; при очень высоких концентрациях А наблюдается тенденция к пересечению кривых в одной точке, как в случае простого конкурентного ингибирования (см. рис. 4.42,5). График зависимости наклонов линейных участков кривых от а будет линейным при высоких концентрациях А; это позволяет определить обычным путем ин-гибиторную константу для A (KiA).

Поведение такого типа наблюдалось в случае нуклеозид-ди-•фосфат — киназы (КФ 2.7.4.6) и оксиметилглутарил-СоА — син-тазы (КФ 4.1.3.5) [3151]; оба этих фермента функционируют по механизму двухстадийного переноса. Конкурентным ингибитором для них является каждый из субстратов.

Конкурентное ингибирование высокими концентрациями субстрата может наблюдаться и в неупорядоченных системах, когда вторая молекула А, образуя комплекс ЕАА, конкурирует <с В. Результат такого ингибирования будет аналогичен таковому для упорядоченных систем; в качестве ингибиторов могут выступать оба субстрата.

2. Бесконкурентное ингибирование высокими концентрациями субстрата. Дальциль [956] рассмотрел случай, когда второй

Рис. 4.42. Конкурентное ингибирование субстратом. А. Кривые, построенные по уравнению (4.219), для упорядоченной системы (4.218). Б. Кривые для системы с двухстадийным переносом (4.121) в случае ингибирования обоими субстратами. л"мА = Л"мв= 1,0; д"г=10; V=100. Л*/=1 (для А).

13* Глава 4

субстрат (В) способен связываться с тройным комплексом в упорядоченной системе

Е 7=fc ЕА 7=fc ЕАВ =р=* EPQ EQ ч=± Е, (4.220)

а Клеланд [803] проанализировал, по-видимому, более часто встречающийся случай, когда В может связываться с двойным комплексом:

Е т—* ЕА -ч—>¦ ЕАВ -<—*- EPQ ч=>: ЕР ¦<—* Е (4.221)

ЕРВ

Учитывая сказанное выше (с. 150—152) о характере ингибирования продуктом в таких системах, можно сделать вывод, что в обеих системах будет наблюдаться бесконкурентное ингибирование в отношении А, так что уравнение скорости будет иметь вид

v=-т——-s-з-й-. (4.222)

1 + Kt + а + Ъ '+ ab

В этом уравнении величина К\ не равна константе диссоциа-' ции ингибирующего субстрата из комплекса ЕРВ — она зависит также от константы скорости образования комплекса ЕР из тройного комплекса EPQ.

В данном случае на графике зависимости l/v от 1/6 наблюдается характерное отклонение вверх при больших значениях 6. График зависимости l/v от 1/а линеен; при высоких концентрациях В длины отрезков, отсекаемых от оси l/v, изменятся, а наклоны останутся прежними. Такой график, взятый из работы Клеланда, показан на рис. 4.43. Вторичные графики зависимости наклонов от 1/6 будут линейными в отличие от вторичных графиков зависимости от 1/6 длин отрезков, отсекаемых от оси l/v, при ингибировании высокими концентрациями субстрата.

Бесконкурентное ингибирование высокими концентрациями субстрата наблюдается, например, в случае изоцитратдегидро-геназы (NADP+) из сердечной мышцы свиньи (КФ 1.1.1.42); при этом 2-оксоглутарат выступает в роли бесконкурентного ингибитора по отношению и к бикарбонату, и к NADPH (см. [803]).

3. Смешанное ингибирование высокими концентрациями субстрата. Если в упорядоченной системе «второй» субстрат может

Кинетика действия ферментов Рис. 4.43. Бесконкурентное ингибироваиие субстратом. Графики уравнения (4.222) для упорядоченной системы (4 221). Значения

констант те же, что и для рис. 4.42. ±

взаимодействовать как со свободным ферментом, так и с тройным комплексом, то уравн

страница 43
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(22.10.2019)