каталитическую активность; в то же время состояние ионизации групп, расположенных в самом активном центре или около него, очень существенно.

Если фермент активен только в одном состоянии ионизации, то из этого (в первом приближении) следует, что активность его будет в значительной мере определяться ионизацией? двух особых групп в активном центре или вблизи него, а именно тех групп, которые в первую очередь ионизируются (нли„ наоборот, деионизируются) при сдвиге рН в кислую или щелоч*-ную сторону от оптимума. Эти группы иногда называют кислой и основной группами фермента. Мы не будем рассматривать другие процессы ионизации, которые могут протекать при сдвиге рН до значений, еще более удаленных от оптимума, так как эти процессы влияют на состояние уже неактивных форм фермента. Правда, молекула фермента может содержать несколько одинаковых групп, которые будут ионизироваться одновременно, но присутствие»в активном центре более одной такой групГлава 4

пы маловероятно. В силу рассмотренных выше обстоятельств влияние рН на скорость ферментативных реакций обсуждают часто с учетом только двух ионизирующихся групп, используя при этом уравнения, применимые к двухосновным кислотам или к простым амфолитам, хотя, без сомнения, такой подход является слишком упрощенным.

рН-функции Михаэлиса

Чтобы облегчить дальнейшее обсуждение вопроса о влиянии рН на активность ферментов и упростить уравнения, рассмотрим вначале свойства некоторых рН-функций, которые играют доминирующую роль в рассматриваемом вопросе. Михаэлис в 1913 г. первым обратил внимание на важность этих функций [3147, с. 48]. рН-функции Михаэлиса определяются следующим образом:

] Кг 1 Н 1 KtK2 г Н2 ' (4.227)

1 Кг , *, 1 н • (4.228)

^ к, КгК2 (4.229)

где Н — концентрация ионов водорода1.

Эти функции описывают поведение веществ, ионизация которых осуществляется в две стадии с константами К\ и Кг, например поведение симметричной двухосновной кислоты АНг, такой, как янтарная кислота, которая существует в трех формах:

АН2 4+ АН" А2-. (4.230)

Следует помнить, что К\ и Кч характеризуют первую и вторую стадии ионизации молекулы и определяются уравнениями (4.232); они не являются константами ионизации отдельных карбоксильных групп. Важность этого разграничения станет ясной позже.

1 Мы будем использовать в этой книге термин «ион водорода», а не такие термины, как «протон», «ион оксония», «ион гидрония», «ион гидроксоиия» и т. д. Три последних термина относятся к гидратированной форме иона водорода, т. е. к ОН3+. В химической термодинамике принято не учитывать гидратацию реагирующих веществ; поэтому, хотя в водных растворах ион водорода гидратирован [1758, с. 41], записывая уравнения реакций, в которых участвует этот ион, мы будем использовать символ Н+, а не ОН3+.

Кинетика действия ферментов Для обозначения суммы концентраций всех различных форм данного вещества удобно использовать индекс так, для рассматриваемой системы

At = [AHJ + [AH-] + [A»-]. (4.231)

Отсюда, подставляя определения констант К\, Кг,

Kf

[АН-] Н „ _[А»-]Н [А»-] № 9о9ч

[АН,] ' Д2~[АН-] = [АН2]^'

получаем

А; = [АН2](1 +^+*^ = [AH2].f, (4.233)

А, = [АНТ Г, (4.234) A4 = [A2-]-/2-. ' (4.235)

Таким образом, количество какой-либо ионной формы вещества находят путем деления всего количества вещества на значение соответствующей рН-функции.

Все три рН-функции взаимосвязаны, и для дальнейшего рассмотрения удобно выразить соотношения между этими функциями и тремя различными форм-ами вещества в следующем виде:

A4 = [AH2H=[AH2].f -^- = [АН2]р- = = [АН"] = [АН! • Г = [АН"] • р- = = [А2"] • / = [А2"] •/--—-= [А2-] • /2" (4.236)

На рис. 4.46, Л приведены графики зависимости 1/f, 1/f" и l/f2~ от рН (напомним, что 1/f, 1/f- и 1/f2- пропорциональны количеству неионизированной, частично ионизированной и полностью ионизированной форм вещества). При построении этих графиков К\ принято равным 10~5, а Кг—10~10 М. Подобные кривые могут быть получены для любой системы с двумя последовательными стадиями ионизации; они отражают ход ионизации не только двухосновных кислот, у которых промежуточная форма имеет один отрицательный заряд, но могут столь же успешно характеризовать ионизацию аминокислоты, у которой промежуточная форма представляет собой биполярный ион с нулевым суммарным зарядом. Кривая для промежуточной формы (1/f-) может вполне точно представлять долю того количества фермента, которое находится в каталитически активной ионной форме, даже если мы и не знаем, ка^сим именно зарядом эта форма обладает. Действительно, именно сходстГлава 4

А

0.5

о

ч р/с, .---

\ * /

\ /'

Д / / \ / /

/ Y Y ^

1 1 Is—L :—1 >—

3 4 5 6 7 8 9 10 II 12 рН

Рис. 4 46. Характер изменения рН-функций при изменении рН. А. Изменение величин, обратных рН-функциям, для системы с двумя ионизирующимися группами, рК которых равны 5 и 10. 5. Изменение величин, обратных рН-функ-циям, для симметричной системы с р/< 7 и 8.

во между такими кривыми и кривыми, характеризующими зависимость активности многих ферментов от рН, и привело Михаэлиса и Дэвидсона к построению соответствующей теории.

Кривая для промежуточной формы достигает максимума при значении рН (рНо, соответствующее оптимуму рН в случае фермента), находящемся посредине между двумя значениями р/С1. Это означает, что

Но=У%Яа. (4.237)

Если рК значительно различаются, как в рассматриваемом случае (рис. 4.46,Л), то при рНо практически все вещество будет находиться в промежуточной форме; дело, однако, обстоит иначе, если константы почти равны по величине, как это показано на рис. 4.46, Б. Действительно, если (в предельном случае) константы равны, то пик кривой для промежуточной формы достигает величины, соответствующей только одной третьей всего количества вещества. В этом случае все три члена в выражениях для каждой рН-функции равны единице и все три формы вещества присутствуют в равных количествах.

1 рК--lgtf.

Кинетика действия ферментов В том случае, когда значения рК значительно отличаются друг от друга, их легко определить по величинам, равным половине максимальных величин, или по «средним точкам» обеих ветвей кривой для промежуточной формы (которая может соответствовать кривой, характеризующей зависимость активности фермента от рН), как показано на рис. 4.46,Л. Если же рК весьма близки, то этот метод расчета неприменим, так как он приводит к большим ошибкам, как это видно из рис. 4.46,5. Правило для определения в таких случаях значений К предложили Олберти и Массей [70]; они вывели его из уравнений, описывающих действие ферментов, но это правило является общим и может быть легко получено из определения величины /_ следующим образом. Из уравнений (4.228) и (4.237) следует, что высота пика кривой для 1/f- при рНо составляет

1 1

/о" л Г к,

l+2V%

(4.238)

Величина Н, при которой функция l/f~ имеет значение, равное половине этой максимальной величины, может быть определена путем подстановки 1/f-, равной половине l/f-o, или 1__KjH__1

Г KiH + Н2 -f КгКг лпг-

2 + 4 у --2

(4.239)

Л1

Это выражение можно упростить до

Н2—(К1+4Н0)Н+Н02 = 0. (4.240)

Полученное уравнение имеет два действительных корня (которые мы обозначим через Н] и Н2), соответствующих половинам максимальных значений на обеих ветвях кривой. Сумма «корней равна выражению в скобках, так что

Ъ+Ъ^Ъ+Щ. (4.241)

Это простое правило дает возможность вычислить Ki, поскольку нам известны концентрации ионов водорода в точках, соответствующих максимуму нашей функции, и в обеих точках, соответствующих половине максимума. Къ после этого может быть определено из уравнения (4.237). Рассмотренный метод весьма ценен для определения констант ионизации фермента по кривым, характеризующим зависимость активности фермента от рН, хотя, к сожалению, точность его оказывается (наименьшей именно в тех случаях, когда неприменимы другие методы вычисления.

Рассматривая рис. 4.46,5 как иллюстрацию применения из-_ ложенного выше метода, отмечаем, что если ориентироваться Глава 4

только на «средние точки» обеих ветвей кривой для I//-, то. значения рК окажутся равными 6,64 и 8,36 вместо истинных значений 7,0 и 8,0. Однако, применяя правило (4.241), найдем, что Hi== 10~6>64= 10~7+0>36 = 2,29-10~7, а Н2 = 4,37-10~9, так что Н1+Н2 = 2,33-10-7. Так как Н0=10-7'5, то 4Н0= 1,26-10~7. Таким образом, Hi + H2—4Н0 = 1,07-10~7, что достаточно хорошо согласуется с истинным значением 1,00-10~7.

Олберти и Массей [70] составили таблицу значений ширины колоколообразной кривой для l/f~ на половине высоты (т. 'е. рН2—рН]), выразив ее через разность между р/0 и рЛ^. и отметили, что при уменьшении разности рЛ^—рК\ (которая проходит через нуль и становится отрицательной при pKi^pKz) значение ее постепенно снижается, асимптотически приближаясь к пределу, когда разность стремится к —оо. В