полученные им уравнения слишком сложны и приобретают практичен скую ценность опять-таки лишь при указанном допущении.

Кинетика действия ферментов Рассматриваемая система может быть представлена в следующем виде (см. [70]):

Ел-1 -т—>¦ Е" <—>- Ел+1

ES"-1 <—>¦ ES" ч—у ESn+1 (4.257) E"-f- P

Каждая из трех констант скорости относится к определенной ионной форме, участвующей в реакции.

При выведении уравнения (4.256) мы допускали, что распадается только одна из форм комплекса ES, но можно предположить, что будут распадаться с одинаковыми или разными скоростями две формы комплекса (хотя, насколько нам известно, ни в одном случае не было показано, что это имеет место). Если, например, могут распадаться ES" и ES"+I, то падение активности до нуля на щелочной ветви кривой рН — активность должно быть связано со следующей стадией ионизации, характеризующейся константой ионизации, которая может быть обозначена через Kesz- Если ES"+1 распадается медленнее, чем ES", то щелочная ветвь кривой рН — активность будет иметь сложную форму с двумя ступенями (которые, однако, могут проявляться недостаточно отчетливо), соответствующими

Kes2 И Kes3-

В некоторых случаях KeS2 не будет влиять на форму кривой. Если группа с константой ионизации Kes2 находится в таком положении в ферментной или в субстратной части комплекса, что ее ионизация не оказывает влияния на реакцию, то обе формы (ES" и ES"+1) будут распадаться с одинаковой скоростью. В области рН, в которой ES" и ES"4-1 существуют вместе (т е. в области, где Н — величина того же порядка, что и

Kes2), f~~es Приближается К ВеЛИЧИНв l+(Kes2/H), a f2-es—к

1 + (H/Kes2); поэтому можно написать

V+ н 1+кш/

Следовательно, в этих условиях, как и следовало ожидать, Kes2 не оказывает влияния на скорость реакции и рассматриваемый случай упрощается до случая распада только одной формы комплекса с кривой рН—активность, полностью определяемой

ВеЛИЧИНаМИ Kesl И KesZ-

Если, однако, группа с константой ионизации KeS2 находится в таком положении в активном центре или вблизи него, что ее Глава 4

ионизация влияет на скорость распада комплекса, то тогда константы k+2 и k~+2, характеризующие распад соответственно ES" и ES"+1, не будут равны. В этом случае результат будет зависеть от природы процесса распада, а именно от того, образуются ли при распаде обеих форм комплекса одни и те же ионные формы продукта или нет. Если в обоих случаях образуются Е"-|-Р, то ясно, что реакции должны быть представлены как

ES"-> Ея + Р

и

ES"+1-T-H+ -> Е" + Р.

Тогда скорость реакции будет выражаться уравнением

v=k+2 * +?-+2 * Н. (4.259)

I es I es

Однако из уравнений (4.236) имеем, что Н//~2=лУ/~ так

что

(4-260)

I es

Это уравнение скорости имеет тот же вид, что и (4.255), за исключением того, что одна константа заменена другой. Таким образом, и в данном случае влияние рН на скорость процесса носит тот же характер, что и прежде; изменяется только интерпретация константы скорости.

Возможно, однако, что при распаде двух форм комплекса будут образовываться продукты, находящиеся в различных ионных состояниях. Например, из ES" может образовываться Еп„ тогда как ES"+1 будет распадаться до E"+1 и лишь затем в результате реакции с ионом водорода давать Е". Хотя оба варианта процесса распада почти идентичны, однако они могут протекать с несколько разными скоростями вследствие влияния дополнительного заряда. Это приводит к уравнению

0==^* +.^8 * (4.261)

i es i es

которое не упрощается таким же образом, как уравнение (4.258), если k+2 и k~+2 заметно различаются.

Остается возможность (хотя в пользу такой возможности, насколько мы знаем, нет доказательств), что в некоторых случаях распад комплекса ES представляет собой процесс, катализируемый ионами водорода, подобно ряду неферментативных

Кинетика действия ферментов процессов распада. В этом случае скорость должна была бы выражаться уравнением

у=?+2Н j?—. (4.262)

Обращаясь теперь еще раз к уравнениям (4.236), находим, что Н//- = Ki/f, так что

»4^.f. (4-263)

i es

Таким образом, в предполагаемом варианте получаем такое выражение для скорости, как если бы распадался комплекс ES"+1, а комплекс ES" не распадался.

Возвращаясь к уравнению (4.256), отметим, что если построить график зависимости lg V от рН, то этот график по своему типу будет аналогичен тому, который изображен на рис. 4.47, так как

igv=igv+pr„. <4-264)

В рассматриваемом выражении первый член справа не зависит ¦от рН. Это уравнение позволяет по положению перегибов на кривой определить рК тех ионизирующихся групп комплекса ES, которые влияют ]Га~актТШ1ость", или, другими словами, тех групп, которые-либо образуют часть активного центра, либо тесно связаны с ним.

В тех случаях, когда наблюдения не охватывают достаточно большого диапазона рН для того, чтобы можно было построить линейные участки по обе стороны от иекомой величины рК, эту величину часто можно определить путем построения графика зависимости 1/V от Н (или 1/Н в зависимости от обстоятельств) Этот метод применим только в том случае, если ионизация других групп не изменяется в пределах рассматриваемой •области рН. Если это условие выполняется, то одним из двух членов (H//(esi или Кез21Щ в уравнении (4.256) можно пренебречь; тогда

Н

1 1+ТГ~

мли

V

График зависимости 1/V от Н или 1/Н представляет собой прямую с наклоном \IKesik+2e или Kesilk+2e, пересекающую ось ординат в точке l/k+2e. Таким образом, по наклону прямой и

1+-

Н Глава 4

длине отрезка, отсекаемого от оси ординат, могут быть определены Kesi или Kes2- Этот метод определения рК использовался Лайдлером [2684] и другими исследователями.

Хотя в литературе и приводятся кривые, характеризующие зависимость рН — активность для многих ферментов, и хотя в ряде случаев было показано, что при оптимальном для активности фермента рН концентрация субстрата была вполне достаточной для насыщения фермента, однако только в отношении очень небольшого числа случаев можно быть уверенным, что это условие выполнялось при всех рассматривавшихся величинах рН. Среди немногочисленных надежных данных, характеризующих зависимость V от рН, можно назвать результаты опытов с фумаратгидратазой (КФ 4.2 1.2) [3018]. По этим данным "построены кривые рН — lg V, приведенные на рис. 4.50, для двух субстрпов — фумарата и малата. Из этих кривых видно, что фермент-фумар'атный комплекс характеризуется рК около 5,7 и 7,7, тогда как для фермент-малатного комплекса эти величины равны приблизительно 7 и (возможно) 9. Не было, конечно, оснований ожидать, что оба комплекса будут иметь одинаковые рК, но следует иметь в виду, что фумарат-гидратаза представляет собой фермент, который обладает особым свойством: она чувствительна к анионам, и потому на характер кривых рН—lg V значительное влияние оказывает присутствие солей.

Лайдлер [2684] построил по литературным данным кривые рН—lg К для холинэстеразы (КФ 3.1.1.8) [1816] и для ксан-

А

Кинетика действия ферментов Рис. 4 51. Зависимость Кп и V от рН при действии холинэстеразы (КФ 3 118) на ацетилхолин [1818]. Верхний график —из работы [1109]; нижний график — из работы [2684].

тиноксидазы (КФ 12 3.2), действующей на 2-амино-4-гидрок-сиптеридин [2879]; эти кривые приведень1__ыа_рис. 4.51 и 4.52. В обоих случаях в изучавшейся области рН наблюдается только одно рК для комплекса ES и отсутствует-ептимальньш рН для V, которая просто увеличивается до некоего постоянного максимального значения.

Весьма необходимы дальнейшие работы по определению рК фермент-субстратных комплексов. В результате сравнения рК комплексов с рК свободных ферментов и субстратов могут быть получены интересные данные о том влиянии, которое оказывает на молекулу субстрата связывание с активным центром фермента.

В то время как измерения скорости реакции при высокой концентрации субстрата позволяют определить рК фермент-субстратного комплекса, измерения при очень низкой концентрации субстрата могут дать рК для свободного фермента и субстрата. Как уже отмечалось выше, при низких концентрациях субстрата v=(V~IKm)s. Зная V/Км, можно определить рК свободного фермента (ср. [70]) и свободного субстрата Основания для этого станут ясными после рассмотрения влияния рН на Км, но кратко можно сказать, что Км зависит от констант ионизации всех трех компонентов, тогда как V является функцией только констант комплекса ES. При рассмотрении отношения этих двух величин константы, относящиеся к комплексу ES, сокращаются и остаются только константы для свободного фермента и субстрата. Однако наблюдения только за изменением величины Км позволяют определить рК всех компонентов, как это будет показано в следующем разделе. Измерения Глава 4

скорости при низкой и высокой концентрациях субстрата полезны для проверки результатов. На рис. 4.52 представлено изменение всех трех величин; логарифмический метод построения, предложенный М. Диксоном [1109], позволяет сравнительн