о легко интерпретировать результаты.

X. Диксон [ПОЗ] отметил, что в том случае, когда ферментативная реакция протекает через ряд последовательных стадий с образованием промежуточных комплексов, ионизирующиеся группы комплексов, определяющие ход ветвей колоколо-образной рН-кривой, не обязательно должны относиться к одному и тому же комплексу. В таком случае лимитирующая стадия при переходе от одной ветви графика рН-зависимости к другой меняется. Тем не менее график имеет нормальную ко-локолообразную форму.

Образование эффективного комплекса ES, в котором субстрат связан с активным центром фермента надлежащим образом, может проходить через несколько промежуточных стадий. В равновесных условиях нет необходимости рассматривать рК этих промежуточных комплексов, поскольку они не влияют на Ks (последняя определяется стандартными свободными энергиями образования Е, S и ES). Однако в стационарных условиях одна или несколько ранних стадий могут оказаться достаточно медленными и лимитировать скорость процесса; тогда рК промежуточных комплексов могут играть некоторую роль. Если мы имеем систему с большим числом последовательных стадий, скорость которых различается, то решить вопрос о том, какой из интермедиатов следует рассматривать как ES, доволь-

Рис. 4.52. Зависимость Км, V и va от рН при действии ксантииок-сидазы (КФ 1.2.3.2) на 2-амино-4-гидроксиптеридии [2879]. / в /// — из работы [2684], 11—из 8 работы [1109].

Кинетика действия ферментов

но трудно. Обычно за ES принимают первый комплекс, стадия превращения которого лимитирует результирующую скорость-процесса в такой мере, что данный комплекс накапливается в-заметном количестве.

Влияние рН на Км

а. Равновесные условия

Уокер и Шмидт [4947] при рассмотрении действия гисти-дин — аммиак-лиазы (КФ 4.3.1.3) описали в общей форме влияние ионизации трех компонентов системы на константу Михаэлиса; они вывели соответствующие уравнения при допущении, что каждый компонент имеет одну ионизирующуюся группу. Позже М. Диксон [1109] проанализировал этот вопрос в более общей форме и предложил ряд правил для интерпретации получаемых данных. Его анализ относится к величине Ks, но он в равной мере применим и к величине Ki для ингибиторов; он представляет собой, таким образом, теорию влияния рН на величины сродства ферментов к субстратам и ингибиторам. При создании этой теории было сделано допущение, что комплекс ES находится в равновесии со свободным ферментом и субстратом, или другими словами, что k+2 мало по сравнению с k-\ и система отвечает условиям теории Михаэлиса. Этот анализ в равной мере применим к величинам Ks и Kt; вопрос о применимости его к величине Км и к кинетике стационарного состояния обсуждается ниже.

Рассматривая систему (4.257), допустим, что, как и прежде,, форма Е" фермента соединяется с неионизированной формой субстрата (который может быть, например, двухосновной кислотой), в результате чего образуется комплекс ES":

Е» 4- S =i=fc ES", (4.265)

и при этом устанавливается равновесие. Константу равновесия Ks определим отношением

Эта константа отличается от обычной субстратной константы' Ks', последняя представляет собой константу равновесия, определяемую в отношении полных количеств Е, S и ES, и зависит от рН, тогда как Ks относится к особым ионным формам компонентов, фигурирующих в выражении (4.266), и не зависит от рН. В данном случае [S] — концентрация неионизированной формы субстрата. Глава 4

Из уравнений (4.223) —(4.225) и определения Ks получаем

К - -[E*] U~ [S] U — К U <Ж7\

est - [Е8»]Г« -~*sTe7-

Это важное уравнение, показывающее, как Ks изменяется в зависимости от рН, удобно представить в логарифмической форме

PKS =РЛГ5 4- lg fes - lg fe~ - lg fs =P*S - Pf« +P/." + P.V (4-268)

Точно такие же уравнения описывают влияние рН на сродство ферментов к ингибиторам

Kt^Kt-^-, (4.269)

/ ei

pK^p^f-pf.j + p/r+P/f (4-270)

Так как различные ионные формы каждого компонента находятся в равновесии между собой, уравнения типа (4 265) и

(4.266) можно написать для любых других ионных форм. Не имеет значения, какие ионные формы, согласно нашему допущению, присоединяются с образованием комплекса ES, и указанный выше вариант соединения выбран как простейший для системы (4.257). Легко показать, что тот же самый результат получается при любом допущении относительно механизма присоединения. Если, например, допустить, что с ферментом связывается вместо незаряженной формы субстрата анион, несущий два заряда, и что комплекс ES остается таким же, как прежде, то вместо уравнений (4.265) и (4.266) мы должны будем написать

e" + s2--f 2н+ = esra, (4.271)

AS2-=-[es^]-- (4.272)

и из уравнений (4.232) —(4.236) и (4 266) получим

к - E«s' - tE"J fe~ [S2"i — l?bs^^

as es, [es"]/-,, № ' f~et

=r_ *«- (4.273)

^slAs2 I ев I es

т. е. тот же самый результат, что и прежде [ср. уравнение

(4.267) ].

Выбор правильной функции для использования в уравнении

(4.268) определяется не какими-либо допущениями относительно механизма образования комплекса ES, а зависит от того, как мы определим константу равновесия, входящую в уравне-

Кинетика действия ферментов яие. Таким образом, написанное выше уравнение содержит /"-функции для Е и ES и /-функцию для S просто потому, что при определении Ks учитывались промежуточные формы Е и ES и незаряженная форма S.

М. Диксон [1109] отметил, что если построить график зависимости —lgKs, или pKs, от рН, то результаты можно будет легко интерпретировать на основе нескольких простых правил,, теоретическую базу для которых составляет уравнение (4.268). Если пренебречь первым постоянным членом, который влияет только на смещение графика вдоль оси ординат, то рК будет равно алгебраической сумме трех членов типа р/, каждый из которых изменяется по тому же закону, что и функции, изображенные на рис. 4.47. Следует, однако, отметить, что, в то время как члены типа р/ для свободного фермента и субстрата имеют те же знаки, что и упомянутые функции на рис. 4.47, члены типа р/ для комплекса ES имеют обратные знаки и их влияние носит противоположный характер. Эти соображения приводят к формулированию следующих правил:

1. График зависимости pKs от рН состоит из прямолинейных отрезков (если рК достаточно сильно различаются), соединенных короткими криволинейными участками.

2. Наклоны прямолинейных отрезков равны 0, ±1 или ±2.

3. Каждый перегиб на кривой дает значение рК ионизирующейся группы в одном из компонентов; если продолжить прямолинейные отрезки, то они пересекутся при значении рН, соответствующем рК.

4. При переходе от одного рК к другому наклон кривой изменяется на единицу.

5. Каждое рК группы, относящейся к комплексу ES, вызывает увеличение (положительного) наклона с увеличением рН, каждое рК группы, относящейся к свободному ферменту или к свободному субстрату, вызывает уменьшение наклона кривой.

6. Кривизна в точках перегиба такова, что расстояние между точкой пересечения продолженных соседних прямолинейных отрезков и касательной к кривой в точке перегиба равно 0,3 единицы (т. е. Ig2). Если при рассматриваемом рН происходит одновременная ионизация двух групп, то расстояние будет равно lg 3.

7. Величина наклона каждого из прямолинейных отрезков численно равна величине изменения заряда, происходящего в рассматриваемой области рН при диссоциации комплекса ES на свободный фермент и субстрат. Если, например, при данном рН и фермент, и комплекс имеют по п отрицательных зарядов, а свободный субстрат находится в незаряженном состоянии, то процесс диссоциации будет протекать в соответствии с уравнением ES"—>iEra-f-S; при этом не будет происходить изменения заряда и наклон отрезка будет равен нулю. Если комплекс имеГлава 4

ет отрицательных зарядов, а субстрат имеет 1 отрица-

тельный заряд, то процесс диссоциации выразится уравнением ES"+1—hE"+S~ и наклон отрезка по-прежнему будет равен нулю. Если процесс диссоциации пойдет по пути ES"~trr4E"+ + S, то изменение заряда будет равно —1 и наклон тоже будет равен —1 и т. д. Наклон отрезка, таким образом, определяется величиной заряда определенных ионных форм компонентов, доминирующих при рассматриваемом рН.

В общем случае по этому признаку, т. е. по изменению наклона, невозможно различить ионизацию свободного фермента и свободного субстрата, но так как константы ионизации субстрата обычно известны или же могут быть определены, то на этом пути практически не возникает значительных трудностей.

Следует отметить, что применимость этих правил не зависит от допущений, определяющих, какие именно ионные формы компонентов соединяются при образовании комплекса ES или какие рН-функции фигурируют в уравнениях. Для того чтобы интерпретировать кривые зависимости pKs — рН с помощью этих правил, вообще не требуется составлять уравнение образования комплекса для данной системы Эти правила в равной мере применимы и при изучении влияния рН на рК, они значительно упрощают интерп