фике видно, что скорость реакции уменьшается со временем. Это уменьшение скорости может объясняться различными причинами. Например, продукты реакции могут угнетать фермент; степень насыщения фермента "с-убстратом может уменьшаться в результате падения концентрации субстрата по мере осуществления реакции; при увеличении концентрации ТТродуктов реакции более существенной может становиться обратная реакция; фермент (или кофермент) может подвергаться инактивации из-за нестабильности в данных условиях температуры или рН; в некоторых случаях может действовать одновременно ряд перечисленных выше причин. Вследствие сказанного кривые хода ферментативных реакций, как правило, не описываются обычными уравнениями для гомогенных химических реакций и получение уравнения, соответствующего экспериментальной кривой, может оказаться очень трудной задачей (гл. 4). Чтобы обойти это затруднение, при изучении ферментативных реакций используют иной подход, а именно измеряют начальную ско-

Методика работы с ферментами Рис. 21. Типичная кривая хода реакции.

рость реакции. В начальный период упомянутые выше различные факторы еще не успевают проявить своего действия и условия протекания реакцир поддаются точному определению. Поэтому при работе с ферментами принято прослеживать изменение начальной скорости реакции под влиянием изменений только одного из факторов, определяющих скорость реакции, при сохранении всех ^стальных факторов постоянными.

Для отыскания"" началыюй_скорости достаточно построить только начальный участок кривой хода реакции и определить тангенс угла наклона в начальной точке. До тех пор пока степень преврашетТйя^-не превысит 20% максимально возможной, графики обычно представляют собой практически прямые линии.

Количество субстрата, прореагировавшего за определенный отрезок времени от начала реакции, может рассматриваться как показатель скорости реакции тряьясцдо тех пор, пока не перейден этот предел. В прошлом очень часто пренебрегали этим ограничением. Следующий простой пример показывает, что подобный подход не дает правильной характеристики процесса. Кривые хода реакции на рис. 2.2,Л могут характеризовать опыты при трех различных значениях рН, с тремя разными субстратами, или с тремя различными концентрациями либо фермента, либо кофермента. Для простоты предположим, что кривые /, // и /// были получены при добавлении 1, 2 и 4 единиц фермента соответственно. Если мы построим график зависимости между начальной скоростью в момент времени t0 и количеством фермента, как это сделано на рис. 2 2, Б, то получим прямую, показывающую, что скорость реакции пропорциональна количеству фермента. Однако количество субстрата, подвергшегося превращению к моменту времени /ь не пропорционально количеству фермента, и сравнение кажущихся скоростей реакции, полученных путем деления соответствующих величин на промежуток времени между t0 и tit дает совершенно ошибочный результат, как это видно из рис. 2.2, Б. Глава 2

Рис. 2.2. Графики, иллюстрирующие необходимость использования величин начальных скоростей А. Кривая хода реакции с трем» различными количествами фермента. Б. Изменение «кажущихся» скоростей, полученных по точкам графика А, в зависимости от количества добавленного фермента.

Число единиц фермента фермента; III — 4 ед. фермеша

Не в каждом случае получают кривую, подобную приведенной на рис. 2.1. Иногда ряд факторов вызывает не уменьшение, а увеличение скорости в течение первой фазы реакции. В этом случае кривая имеет S-образнуюПШГаутокаталитическую, форму с максимумом скорости в одной из промежуточных точек. В таком случае совсем нелегко решить, как охарактеризовать активность фермента — по начальной скорости, максимальной скорости или по наклону кривой в какой-либо другой точке.

По-видимому, общего правила нет, и в каждом случае следует поступать с учетом особенностей системы. Лучшим путем является установление причины ускорения (это часто удается сделать, проведя нескольк1ГТтрТ;дварительных экспериментов); затем модифицируют процедуру определения так, чтобы устранить действие обнаруженной причины, и обычным путем определяют начальную скорость. Например, оксидаза D-аминокис-лот (КФ 1.4.3.3) функционирует при участии флавинового ко-фермента, который относительно медленно связывается с ферментом; в результате количество «активного фермента» в течение некоторого периода времени после смешивания реагентов

Методика работы с ферментами возрастает и наблюдается ускорение реакции [1116, 1117]. Зто осложнение можно устранить, если вначале проинкубировать фермент с коферментом и запускать реакцию добавлением субстрата. В другом случае в концентрированном исходном растворе фермент находится в частично активной агрегированной форме; при разведении инкубационной смесью происходит его диссоциация (не мгновенная) в полностью активную форму. В этом случае к инкубационной смеси сначала следует добавить фермент, а затем субстрат. Далее в исходном растворе фермент может обратимо комплексироваться с примесным металлом-ингибитором; при разведении же комплекс диссоциирует. В данном случае следует поступать так же, как в предыдущем. В особом случае, приведенном на рис. 4.16, основная реакция начинается только тогда, когда исчерпывается конкурентный субстрат, выступающий как ингибитор; здесь за начальную скорость можно принять наклон прямолинейного участка.

В дальнейшем изложении (а также в главе по кинетике), когда пойдет речь о скорости реакции, под этим следует понимать начальную скорость, если не сделано специальных оговорок.

ТИПЫ МЕТОДОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ ИЗУЧЕНИИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

Различают два типа методов изучения ферментативных реакций: методы, связанные с отбором проб, и непрерывные методы. В первом случае за самой реакционной смесью не следят, а через определенные промежутки времени отбирают пробы и в результате измерений получают ряд отдельных точек, по, которым строят кривые хода реакции. Во втором случае наблюдения проводят (по ходу реакции) над самой реакционной смесью: при этом с помощью большого числа измерений или автоматической регистрации удается получать непрерывные кривые хода реакции.

При работе по методу отбора проб измеряют обычно концентрацию либо субстрата, либо продукта реакции. Если реакция проста, то для измерения ферментативной активности можно использовать оба этих пути; однако при двухстадийной реакции, в ходе которой может накапливаться промежуточный продукт, результаты, полученные этими двумя различными способами, не обязательно совпадают. При двухстадийной реакции скорость первой стадии правильно характеризуется только убылью субстрата.

В особых случаях, например при гидролизе белков и полисахаридов, мотекула которых содержит много связей одного и того же типа, атакуемых одним и тем же ферментом, глубину реакции принято оценивать по числу гидролизованных связей, Глава 2

а для определения степени гидролиза использовать такие методы, как формольное титрование или измерение восстановительной способности.

В опытах с отбором проб в каждом случае определения скорости обычно необходимы измерения по крайней мере в трех точках: в одной при нулевом отсчете времени, во второй по прошествии определенного выбранного промежутка времени и в третьей по истечении примерно вдвое большего времени. Это дает возможность проверить линейность графика на протяжении рассматриваемого промежутка времени. Каждую пробу необходимо немедленно после отбора смешивать с реагентом, мгновенно останавливающим ферментативную реакцию, так чтобы проба точно отражала состав реакционной смеси в определенный момент. Поскольку используемые реагенты всегда высокотоксичны для ферментов, необходимо соблюдать большую осторожность и ни в коем случае не вносить в реакционную смесь следы реагента (например, на кончике пипетки).

Большинство методов, используемых для изучения ферментативных реакций, относятся к непрерывному типу, им исследователи обычно отдают предпочтение. При работе с помощью этих методов необходимо, в сущности, одно — получить достаточное число отсчетов, чтобы быть уверенным в том, что соответствующие точки укладываются на прямую. Если же используется непрерывно регистрирующий прибор, то скорость определяют по наклону прямой. В некоторых случаях прибор может непосредственно регистрировать скорость процесса: так, например, в системе люциферазы интенсивность люминесценции прямо пропорциональна скорости ферментативной реакции [746].

НЕКОТОРЫЕ ПРАКТИЧЕСКИЕ СООБРАЖЕНИЯ

Здесь мы коснемся некоторых на первый взгляд тривиальных моментов техники работы с ферментами. Для получения линейной зависимости между количеством фермента и скоростью реакции условия в реакционной смеси должны, насколько это возможно, поддерживаться постоянными в течение всего периода наблюдении. Реакцию следует проводить в термостате, и прежде чем в результате смешения реагентов начнется реакция, каждый из них следует довести до требуемой температуры. Необходимо предусмотреть достаточное забуферивание растворов для п