Биологический каталог




Ферменты. Том 1

Автор М.Диксон, Э.Уэбб

6,8 7,2 16 8,0 рН

Рис. 4.58. Соответствие между процессами инактивации фермента и? денатурации белка [3470]. Фермент — пепсин А (КФ 3 4.23 1),. Т=20°С.

тивности вооружает специалиста в области химии белка быстрым методом, с помощью которого он может вести наблюдение за ходом денатурации.

Высокий температурный коэффициент тепловой денатурации означает, что процесс денатурации характеризуется большой величиной теплоты активации. Применив теорию абсолютных скоростей реакций (см. [4472]), можно рассчитать свободную энергию и энтропию активации этого процесса; было найдено, что величины свободной энергии лежат в обычных пределах1 и высокие значения теплоты активации данного процесса определяются исключительно высокими положительными" значениями энтропии активации. Это обстоятельство было интерпретировано как указание на то, что при денатурации белков и ферментов разрывается большое число слабых связей, например водородных. Такая интерпретация согласуется с общепринятым представлением о денатурации как о «раскрывании» молекулы путем развертывания пептидных цепей или расхождения соседних участков цепей.

Скорость инактивации ферментов (как и вообще денатурации белков) в большинстве случаев сильно зависит от рН раствора. Влияние рН на инактивацию различных ферментов может быть весьма различным. Обычно имеется область максимальной стабильности фермента, причем она не обязательно» располагается поблизости от его изоэлектрической точки; ин-

1 Из приведенной в статье Стирна [4472] табл. 1 следует, что свободная энергия активации процесса денатурации характеризуется замечательным постоянством. Это, однако, является просто следствием того обстоятельства, что исследователи стремились выбирать такие температурные условия, при которых скорость денатурации легко поддается измерению. Так как скорость процесса определяется величиной свободной энергии активации, то естественно, что при этом должны получаться близкие значения для рассматриваемой величины.

Кинетика действия ферментов активация увеличивается при сдвиге в кислую и щелочную сторону от этой области. Многие ферменты уже при рН 4—5 и 8— 10 инактивируются даже при комнатной температуре. Так как параметры инактивации значительно изменяются с изменением рН, то следует проявлять осторожность при выведении каких-либо заключений общего характера из наблюдений, относящихся только к одному значению рН. Другие факторы, помимо рН, например ионная сила, концентрация белка и защитное действие субстратов, ингибиторов и прочих веществ, также могут оказывать значительное влияние на скорость инактивации. Имеет значение также и содержание воды, ибо в высушенном состоянии ферменты весьма термостабильны.

В ряде случаев тепловая денатурация оказывается обратимой. Ярким примером может служить нуклеотид-пирофосфата-за (КФ 3.6.1.9) Proteus vulgaris, которая полностью инактиви-руется за 10 мин при 70 °С и полностью реактивируется при охлаждении до 37 °С. Непрогретые препараты фермента содержат термолабильный ингибитор, и фермент остается неактивным до тех пор, пока ингибитор не будет удален в результате нагревания до 100 °С в присутствии субстрата фермента (пирофосфата), который предохраняет фермент от инактивации [4601].

В некоторых случаях обратимой тепловой денатурации оказывается возможным определить равновесие между активной и неактивной формами фермента. Правда, проделать это без нарушения равновесия обычно весьма трудно. Практически единственные ферменты, с которыми были проведены такого рода исследования, — это трипсин (КФ 3.4.21.4) и оксидаза L-аминокислот из змеиного яда (КФ 1.4.3.2) [2373]. Равновесие при изменении температуры довольно быстро смещается. Для трипсина в 0,01 н. НС1, в которой денатурация полностью обратима, процент денатурированного белка в состоянии равновесия равен 33 при 42 °С, 50 при 44 °С и 80 при 50 °С. Процесс денатурации трипсина эндотермичен, теплота денатурации составляет около 68 000 кал/моль, а изменение энтропии (которое не зависит от температуры) 213 кал/(моль-град). Эти величины значительно выше, чем теплота и энтропия активации процесса денатурации, которые имеют значения соответственно 40 200 кал/моль и 44,7 кал/(моль-град). Такое соотношение, т. е. тот факт, что теплота и энтропия определенного процесса выше, чем теплота и энтропия активации того же процесса, совершенно необычно и представляет собой замечательную особенность процесса денатурации белков. Рис. 4.59 изображает это соотношение в схематическом виде. Для сравнения на рис. 4.60 показан более обычный тип соотношений.

Хотя стабильность ферментов, как правило, наиболее высока при низких температурах (поэтому выделение ферментов Глава 4

обычно проводят в холодной комнате), известны и случаи (правда, редкие), когда стабильность при 0°С оказывается ниже, чем при комнатной температуре. Бактериальная глута-матдекарбоксилаза (КФ 4.1.1.15) стабильна при 25°С, однако при 0°С ее активность в течение примерно 1 ч снижается приблизительно вдвое [4269]. Падения активности не наблюдается при предварительном добавлении пиридоксальфосфата (фермент представляет собой пиридоксальфосфатпротеид), в присутствии сывороточного альбумина или в условиях высоких концентраций глицина. После инактивации при 0°С частичное восстановление активности наблюдается при добавлении пиридоксальфосфата, однако при добавлении альбумина или глицина или же после повторной инкубации при 25 °С активность не восстанавливается. Наблюдаемое поведение объясняют тем, что присоединение простетической группы стабилизирует белок; диссоциация же простетической группы представляет собой экзотермический процесс, и, следовательно, при охлаждении создаются более благоприятные условия для диссоциации.

Другого рода примером может служить неустойчивость аде-нозинтрифосфатазы митохондрий при охлаждении [3761]. Этот фермент довольно быстро инактивируется при 0°С, но при комнатной температуре он стабилен и даже обнаруживает медленное увеличение активности. Субстрат (АТР), который предохраняет фермент от инактивации при повышении температуры или при диализе, не предохраняет его от инактивации при низкой температуре. При повышении температуры от 0°С до комнатной температуры наступает лишь частичная реактивация, так что снижение активности при охлаждении не может являться просто следствием сдвига равновесия между активной и неактивной формами фермента. Такая чувствительность к охлаж-

/Денатурированный белок

Антивировонное состояние

„J,,,„ . i Рис. 4 59. Изменение Н для про-

Нативныи белок rir л%

иесса денатурации трипсина (К Ф 3.4 21.4).

Кинетика действия ферментов

И

Рис. 4 60. Изменение Н для типичной химической реакции.

дению свидетельствует о том, что реакция инактивации характеризуется отрицательным АЯ; это позволяет предполагать также отрицательное изменение энтропии; последнее обстоятельство является неожиданным, поскольку можно было ожидать, что неактивное состояние имеет менее упорядоченную структуру. Известны, однако, случаи, когда кристаллизация макромолекулярного вещества сопровождается увеличением энтропии [4470]; полагают, что это обусловлено освобождением связанных молекул воды, сопровождающим образование водородных сйязей.

Те чувствительные к охлаждению ферменты, которые были детально изучены, по-видимому, состоят из субъединиц и активны в полимеризованном состоянии. Процесс полимеризации сопровождается, как можно предполагать, понижением энтропии; если, однако, при этом в результате образования гидрофобных связей между субъединицами происходит освобождение молекул воды, то суммарный процесс может характеризоваться увеличением энтропии и, следовательно, «положительной» теплотой полимеризации. В этом случае низкая температура будет благоприятствовать диссоциации и утрате активности.

Влияние температуры на собственно ферментативную реакцию

Как уже указывалось, ферментативная реакция в целом состоит по крайней мере из тре^с^лшхдедовательных- стадий, а именно стадии образования фермент-субстратного комплекса, стадии превращения этого комплекса в комплекс фермент — продукт и стадии диссоциации продукта. Влияние" температу-

16—2277 Глава 4

ры на реакцию в целом является результатом ее влияния на каждую из этих стадий. Это означает, что имеется по крайней мере 18 термодинамических параметров для всей прямой реакции, а именно*тёпловой эффект, свободная энергия и энтропия процесса активации и тепловой эффект, свободная энергия и энтропия собственно процесса для каждой из трех стадий (табл. 4.11). Во всех изученных до сих пор случаях определялась, однако, лишь небольшая часть этих величин. Необходимо признать, что нам известно об указанных величинах очень мало и что те значения, которые приводятся для них в литературе, весьма сомнительны по ряду соображений (этих соображений мы коснемся ниже).

В идеале следовало бы измерить абсолютные величины каждой из отдельных констант скорости, упоминавшихся в разд. Е, и изучить влияние температуры на каждую из них. При на

страница 53
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Ферменты. Том 1" (3.77Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [обратная связь]

п»ї
Rambler's Top100 Химический каталог

Copyright © 2009
(15.12.2019)