учаев наклон графика меняется и он принимает вид ломаной линии. Это означает,

Кинетика действия ферментов Реакция Катализатор Е, кал/моль

Гидролиз сахарозы Н+ 26 000

» » «Сахараза» солода 13 000

Дрожжевая «сахараза» 11 000

Гидролиз рафинозы То же 11000

что при определенной критической температуре меняется величина энергии активации. Для объяснения этого явления был выдвинут ряд гипотез.

1. Изменение фазового состояния растворителя. Трипсин (КФ 3.4.21.4) и пепсин (КФ 3.4.23.1) изучали при очень низких температурах и в каждом слу4ае наблюдали значительное изменение энергии активации при температурах, близких к 0°С. Для липазы соответствующая величина равна при отрицательных температурах 37 000 кал, а при положительных — 7600 кал. При этом, однако, оказалось, что изменение энергии активации не связано с переходом воды из жидкого состояния в твердое: те же результаты получались и в том случае, когда замерзание предотвращали проведением опыта в условиях высоких концентраций глицерина [4314]. Подобные изменения энергии активации характерны для ряда ферментов, которые образуют комплексы с компонентами мембран. Во многих случаях такие изменения коррелировали с изменением фазового состояния связанных липидов (см., например, [2675, 3801]).

2. Существование двух параллельных реакций с различными температурными коэффициентами (например, двух реакций, катализируемых разными активными центрами). Скорость реакции, характеризующейся более высоким температурным коэффициентом, увеличивается с ростом температуры быстрее, чем скорость второй реакции, так что первая реакция при более высоких значениях температуры становится доминирующей. Поэтому можно было бы ожидать, что при более высоких значениях температуры мы будем наблюдать более высокую энергию активации, и кривая, описываемая уравнением Аррениуса, будет для данного случая вогнутой. Обычно, однако, дело обстоит как раз наоборот. Кроме того, согласно этой теории, отчетливый перегиб кривой может наблюдаться лишь при очень значительных различиях в величине энергии активации.

3. Существование двух последовательных реакций с различными температурными коэффициентами. Реакция с более высоким коэффициентом будет более быстрой при высоких значениях температуры, и процесс в целом будет лимитироваться «торой реакцией, энергию активации которой мы будем наблю-

-52

Глава 4

i

дать в опыте. Это должно дать на графике ломаную линию того типа, который обычно наблюдается в опыте и при котором меньшая энергия активации соответствует более высоким значениям температуры. Кривая, описываемая уравнением Аррениуса, будет в этом случае выпуклой. Теоретическое рассмотрение такой системы приведено у Стирна [4472].

4. Существование фермента в двух формах, обладающих различной активностью. Если фермент существует в двух активных формах, находящихся в равновесии друг с другом, но характеризующихся различными энергиями активации, и если влияние температуры на переход одной формы в другую достаточно четко выражено, то на графике будет наблюдаться отчетливый излом (изменение наклона). Согласно работе [4314], уреаза (КФ 3.5.1.5) в восстановленной форме характеризуется энергией активации 8700 кал, а в окисленной 11700 кал. В опытах с ферментом, находящимся в одной из этих форм, не наблюдалось изменения наклона графика. В слабовосстановительной среде перелом отмечался при 22°С; выше этой температуры наблюдали энергию активации, характерную для восстановленной формы, а ниже^—энергию активации, характерную для окисленной формы. Сайзер предполагает, что с повышением температуры фермент довольно быстро переходит из одной формы в другую, однако не вполне ясно, почему должен происходить такой переход. Кистяковский и Ламри [2475] не наблюдали на графиках такого изменения наклона и выдвинули другое объяснение, которое мы обсудим ниже, в п. 5. Массей [3011], изучавший действие фумаратгидратазы в щелочных растворах, наблюдал изменение наклона прямых: более высоким значениям температуры соответствовали более высокие значения энергии активации. Насколько нам известно, это единственный случай, когда график, описываемый уравнением Аррениуса, оказывается вогнутым. Этот график (рис. 4.62) отличается от графика, описывающего действие того же фермента в кислых растворах (см. ниже, п. 6), тем, что он сохраняет свой характер при использовании двух различных субстратов— фумарата и малата; тем, что излому в этом случае не соответствует перегиб на кривой Км, и тем, что с изменением рН критическая температура изменяется от 22 до 32 °С. Массей считает, что мы имеем здесь дело с диссоциацией фермента (при повышении температуры) на субъединицы меньшей молекулярной массы и что реакция, катализируемая субъединицами, характеризуется более высокой энергией активации. Диссоциация на субъединицы, подобно денатурации, может характеризоваться высоким температурным коэффициентом.

Для АТРазы миозина (КФ 3.6.1.3) в определенных условиях, например в присутствии динитрофенола или актина, график, описываемый уравнением Аррениуса, в области 16 °С ока-

Кинетика действия ферментов

25а

Рис. 4.62. Графическое определение энергии активации с помощью уравнения Аррениуса для прямой и обратной реакций в присутствии фумаратгидратазы (К Ф 4.2.1.2) в щелочном растворе [ЗОН].

зывается выпуклым. Если субстратом является не АТР, a ITP, то и в отсутствие динитрофенола и актина на графике наблюдается излом [2786, 2787]. Это объясняют изменением конфигурации фермента, которое предотвращается при соединении его с субстратами, содержащими 6-аминогруппу.

5. Обратимая инактивация фермента. Кистяковский и Лам-ри i[2475] рассматривают случай, когда неактивная и активная формы фермента находятся в состоянии равновесия, а тепловой эффект превращения одной формы в другую равен АЯС. В этом! случае графики, описываемые уравнением Аррениуса, будут представлять собой прямые, если фермент будет находиться преимущественно в активной или преимущественно в неактивной форме. В первом случае наклон будет равен Е, во втором' Е—Д#с. Кистяковский и Ламри вновь изучили поведение уреа-зы и пришли к заключению, что сульфит, использованный в качестве мягкого восстановителя, вызывает обратимую инактивацию фермента. Они предполагают, что изменения наклона графиков можно объяснить таким же образом и в случае других ферментов.

6. Изменение наклона, наблюдающееся только на графике-для прямой реакции. Массей [ЗОН] в опытах с фумаратгидраГлава 4

а

/8°

ч

оЧ

i \ 1 330 350 j 10s

'Рис. 4 63. Графическое определение энергии активации по уравнению Аррениу-«са для прямой и обратной реакций в присутствии фумаратгидратазы в кислом растворе [ЗОН]. А. Прямая реакция. Б. Обратная реакция.

тазой, действующей в кислой среде, наблюдал изменение наклона прямой при температуре около 18 °С. Эта критическая температура практически не зависит от рН (рис. 4.63,А). Для реакции, протекающей в обратном направлении (с малатом в качестве субстрата), подобного изменения наклона не наблюдалось (рис. 4.63,Б). Изменение энергии активации при критической температуре сопровождается в этом случае равным и противоположным по знаку изменением величины «кажущейся» теплоты связывания фермента с фумаратом, определяемой по влиянию температуры на Км (исходя из допущения, что Ки представляет собой константу равновесия) (рис. 4.64). Значения АЯ в двух температурных областях (выше и ниже 18°С) при рН 6,35 приведены на рис. 4 66. Так как изменение наклона графика наблюдается только для реакции гидратации, то Массей предполагает, что оно может быть связано с влиянием температуры на ориентацию молекул воды, участвующих в реакции. Однако на этой основе трудно объяснить кажущееся изменение сродства фермента к фумарату, а также обнаруженное позднее [3012] изменение его сродства к ингибитору (рис. 4.65). По-видимому, в кислой среде при температурах выше и ниже критической существуют два различных фермент-фума-ратных комплекса, каждый из которых является реакционно-способным. В нейтральной же среде изменения наклона графика вообще не наблюдается.

Кинетика действия ферментов

255-

&Н = 400 кал

2,6

18°

2,2

Рис. 4 64. Влияние температуры на величину /См для прямой и обратной реакций в присутствии фума-ратгидратазы в кислом растворе

2,0 360

[ЗОН].

В случае обратимых реакций можно по данным измерений Ks и V для прямой и обратной реакций определить теплоту образования ES и ЕР и энергию активации прямой и обратной реакций (т. е. ДЯ^, ДЯ^, ДЯ2; и АН2Ь). По этим данным с помощью последнего уравнения, приведенного в примечании к табл. 4.11, можно вычислить теплоту суммарной реакции и, сравнив ее с известной величиной, таким способом проверить достоверность данных. Следует отметить, что в этом уравнении оба выражения в скобках соответствуют высоте главного пика над исходным уровнем для реакций в прямом и обратном направлениях, а разность между ними должна равняться суммарному те