летке, потому что они также могут выбирать те или иные вещества из множества присутствующих в окружающей среде соединений. Наконец, специфичный катализатор благодаря своей структуре определяет среди множества возможных путей тот единственный путь, по которому должно пойти превращение веществ Он обладает способностью направлять реакцию по одному определенному пути..

Быть может, не все согласятся со мной в том, что именно эта направленность, которую придают процессам обмена заключенные в специальном коллоидальном аппарате клетки внутриклеточные ферменты, и составляет основную особенность клетки как системы, поддерживающей динамическое равновесие с окружающей средой. Я отнюдь не отрицаю существования в клетке еще не известных механизмов, обладающих организующим влиянием совершенно другого порядка, на другом (возможно, более высоком) уровне Однако, очевидно, что взаимосвязанное действие высокоспецифичных катализаторов представляет собой замечательное приспособление природы, сохранившее в ходе эволюции те динамические проявления, которые характеризуют живые существа».

Специфичность действия ферментов У тех, кто изучает процессы метаболизма, не остается сомнений в том, какую важную роль играет специфичность ферментов в выборе наиболее выгодных направлений процессов обмена, иными словами — в организации этих процессов из химических реакций различных типов, т. е. «организации на основе специфичности». Если бы ферменты не обладали специфичностью, их действие приводило бы к быстрому распаду клеточного материала; при этом не происходило бы ни образования богатых энергией промежуточных продуктов, ни самого биосинтеза.

Степень наблюдаемой специфичности у разных ферментов варьирует Во многих случаях фермент действует только на одно вещество и катализирует только одну реакцию В других случаях фермент может действовать на ряд близкородственных веществ, катализируя, однако, всякий раз одну и ту же реакцию Очень часто при этом в молекулах различных соединений, на которые действует данный фермент, удается обнаружить одну и ту же химическую группировку. Для ферментов с более широкой специфичностью такие химические группировки обычно составляют сравнительно небольшую часть всей молекулы субстрата (примером могут служить альдегидная или эфирная группа), поэтому такие ферменты способны атаковать большое число родственных веществ.

В настоящее время довольно трудно дать удовлетворительное объяснение специфичности действия ферментов. Причины этого заключаются в следующем:

1. Значительное число ферментов обладает, по-видимому, абсолютной специфичностью, т. е. фермент может атаковать только один субстрат или (в случае бимолекулярной реакции) только одну пару субстратов. В отношении таких ферментов анализ практически невозможен. Только при рассмотрении менее специфичных ферментов, действующих на целый ряд родственных субстратов, можно обсуждать влияние модификаций различных частей молекулы субстрата на скорость превращения. В связи с этим, как правило, в публикуемых работах обсуждаются менее специфичные ферменты, а это может приводить к неправильным представлениям.

2. Во многих обстоятельных исследованиях, посвященных выяснению специфичности отдельных ферментов, ферментные препараты не были должным образом очищены, хотя на получение чистых субстратов в тех же исследованиях были затрачены большие усилия. Данные таких работ были тем самым значительно обесценены, ибо нельзя быть уверенным в том, что все наблюдавшиеся реакции катализировались одним и тем же ферментом.

3 В других работах дело обстояло как раз наоборот: исследователи обратили основное внимание на получение чистого Глава 6

\

фермента, но при этом не провели надлежащей очистки субстрата. Между тем при использовании некоторых методов изучения ферментативных реакций (например, таких, как наблюдение за появлением полосы поглощения NADH в дегидрогеназ-ных реакциях) незначительные количества примесей, играющих роль субстратов, могут совершенно исказить результат.

4. В некоторых работах, проведенных с кристаллическими ферментами, для опыта брали относительно большие количества фермента. Если в подобных условиях реакция с добавленным веществом протекала медленно, то трудно решить, катализировалась ли она изучаемым ферментом или другими ферментами, присутствовавшими в виде примесей в кристаллическом препарате. Если даже чистота кристаллов составляла 99,99%, то и тогда наличие примеси другого активного фермента в ничтожном количестве (0,01%) могло обусловить достаточную активность, которая и обнаруживалась в опыте.

5. В подавляющем большинстве исследований определяли только скорость реакции с серией субстратов при постоянной концентрации последних. Различия между отдельными субстратами могут касаться либо скорости реагирования комплексов ES, либо величины сродства, т. е. либо V, либо Ks. Только в очень немногих работах специально изучалось влияние структуры субстрата как на V, так и на Ks- \

ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

При исследовании вопросов о специфичности какого-либо фермента необходимо обращать внимание на ряд обстоятельств. Некоторые из них мы уже упоминали. Фермент должен быть тщательно очищен, лучше всего — несколько раз перекристаллизован. В любом случае он не должен содержать следов другого фермента, действующего на сходные субстраты. Субстраты также должны быть, насколько это возможно, чистыми и не должны содержать веществ, на которые действует исследуемый фермент. Если субстратом для действия фермента служит оптически активное вещество, то надо стараться исследовать действие фермента на оба изомера раздельно, так как вполне возможно, что фермент будет атаковать только один изомер <с. 336) и что присутствие другого будет тормозить реакцию. Известно, например, что D-аспарагин конкурентно подавляет дезаминирование L-аспарагина, происходящее под действием аспарагиназы [1691].

При проведении исследований обычно выбирают наиболее специфичный для данного фермента биологический субстрат и прежде всего определяют оптимальные условия для действия фермента. Затем испытывают ряд других возможных субстратов при тех же значениях рН, температуры и концентрации.

Специфичность действия ферментов Если один и тот же фермент атакует несколько субстратов, то для получения количественных данных лучше всего для каждого субстрата построить график зависимости скорости реакции от концентрации субстрата по методу Лайнуивера — Бэр-ка и путем экстраполяции определить величины V и /См (см. примеры в табл. 6.5). В случае ионизирующихся субстратов следует построить график для нескольких значений рН, так как с различными субстратами оптимум рН для данного фермента может оказаться различным. Это необходимо потому, что различные субстраты могут иметь неодинаковое сродство к ферменту и при стандартной концентрации в разной степени его насыщать. Для таких субстратов кривые рН—активность будут различны, и при стандартном рН скорость реакции для каждого субстрата будет составлять различную долю от максимальной. Во всяком случае, необходимо отдельно определять величины V и /См, для того чтобы установить, какое влияние оказывает изменение структуры на сродство фермента к субстрату и на лабильность фермент-субстратного комплекса.

Даже если фермент действует только на один субстрат, то можно изучать влияние структуры на сродство, применяя конкурентные ингибиторы, т. е. вещества, для которых V = 0. В этом случае вместо /См определяют Кг-

Чтобы избежать реакций, обусловленных возможным присутствием следов других ферментов, изучаемый фермент всегда следует брать для опыта в достаточно низкой концентрации. Побочные реакции возможны даже при использовании сравнительно чистых ферментных препаратов, если эти препараты берутся в большом количестве.

Общий путь исследования специфичности сводится к следующему. Прежде всего находят подходящий для данного фермента субстрат. Затем несколько изменяют отдельные части его молекулы и определяют влияние этих изменений на сродство к ферменту и на реакционную способность комплекса ES. Нередко бывает необходимо проделать это с несколькими субстратами. В большинстве ферментативных реакций участвует более одного субстрата. Так, например, ферменты переноса катализируют реакцию между донором и акцептором, и даже гидролитические ферменты, когда они катализируют обратную реакцию, осуществляют реакцию между двумя различными молекулами. В подобных случаях необходимо изучать два ряда соединений для того, чтобы определить специфичность фермента по отношению к субстратам каждого ряда в отдельности.

На основании полученных результатов можно сформулировать минимальные требования к структуре субстрата, обеспечивающей соединение с ферментом и осуществление реакции, а также произвести количественную оценку влияния дополнительных групп. Эти данные часто позволяют составить представлеГлава 6

ние о характере образования фермент-субстратного комплекса, о природе участвующих групп и о механизме данной ферментативной реакции.

Если