амат также ие выделяется, и ход реакции сложно контролировать. Образующийся дипептид может снова вступать в реакцию N-ацилнрования, давая ангидрид, который затем атакует третья аминокислота н т. д.

Метод с использованием ангидрида Лейкса наилучшим образом подходит для синтеза гомополимеров. Однако тщательно контролируя условия реакции (0°С, рН 10,2), удается остановить реакцию на стадии образования карбамата и присоединить следующее мономериое звено, а затем продолжать реакцию, деблокируя аминогруппы. Этим способом были синтезированы длинные полипептидные цепи с заданной последовательностью.

Твердофазный синтез (метод Меррифильда) [8]

Этот метод можно рассматривать как комбинацию описанных выше методов (использование защиты амино- и карбоксигрупп, конденсирующих агентов и т. д.), но с существенным упрощением, касающимся обработки промежуточных соединений в классическом варианте синтеза. При применении твердофазного синтеза устраняется необходимость выделять продукт каждой реакции в чистой кристаллической форме, избыток реагентов и побочные продукты отделяют с помощью простого фильтрования и отмывки соответствующими растворителями.

Биоорганическая химия аминокислот

89

HCHO.HCI.4

или

СН2-гС1 XqO R

О NH—гВОС

СН,—О—С—СН

быстро,но хслоВу

CFjCOOII или HCl/АсОИ

NH—/ВОС

/

NH—<врс

СН2—О—С—СН

ч

NH2

о о

II II

:Н2—О—С—СН—NH—С—СН—NH/BOC R R'

Это равнозначно существенному снижению объема работы, особенно при синтезе длинных полипептидов. В основе метода лежит использование нерастворимой по-листирольной матрицы.

Реакционный центр вводится в полимерный носитель реакцией хлорметили-рования. Выше уже отмечалось, что бензилхлорндный остаток принимает участие в Б^-замещеиии и легко взаимодействует с карбоксигруппой, которую в свою очередь нетрудно удалить (ацидолиз) на более поздних стадиях. Отметим, что если бы в реакции замещения участвовала аминогруппа, то последующее снятие

90

Глава 2

аминокислоты с полимера было бы невозможным. После того как аминокислота ковалентно закреплена иа полимере, можно удалить /-ВОС-группировку кислотной обработкой, ие затрагивающей бензнльную связь. Деблокированная аминогруппа может теперь вступить в реакцию со второй аминокислотой (/-ВОС-за-щищеиной) с образованием пептидной связи, затем <-ВОС-защита удаляется, и дипептид, связанный с полимером, может вступить в реакцию с третьей аминокислотой и т. д. После каждой реакции требуется лишь отфильтровать продукт, ковалентно присоединенный к полимерному носителю, и отмыть непрореагиро-вавшие компоненты и побочные продукты. После окончания синтеза пептид заданной последовательности снимается с носителя обработкой НВг или HF в три-фторуксусиой кислоте.

Можно использовать любой конденсирующий агент, хотя наиболее широкое употребление получил ДЦГК. ДЦГК позволяет использовать для синтеза пептидов все аминокислоты, кроме аспарагииа и глутамина (амндиые боковые цепи которых дегидрируются до нитрилов). Интересно отметить, что при синтезе на полимерном носителе механизм реакции с ДЦГК отличается от механизма реакции в растворе [9]. Это вполне понятно, поскольку ДЦГК и растворенная аминокислота находятся в избытке по отношению к нуклеофильным аминогруппам, ковалентно связанным с носителем. Поэтому реакция аигидридоподобного промежуточного соединения с карбоксильной группой второй молекулы свободной аминокислоты более вероятна, чем с аминогруппой, иммобилизованной на полимере.

ангивриоопоЗобныи интермейиат (ДЦГК и свобоЗной аминокислоты)

HN О

| || /nh- Z

с—о-с—сн(

О

сн—с—nh-ch(

nh <Г°-

оипептиВный пройуктп, связанный с полимерам

полимерная 1уматрии,а

/сн\

r nh—'z

Поскольку обработка реакционной смеси после образования каждой последующей пептидной связи (удлинения полипептида) очень упростилась, стало возможным автоматизировать процесс синтеза, что, таким образом, привело к ускорению полипептидного синтеза. Таким методом был проведен первый химический синтез фермента (панкреатическая рибоиуклеаза быка, 124 аминокислотных остатка).

Биоорганическая химия аминокислот 91

ОН

Следует указать, что с разработкой даже столь простой методики, как твер-офазный метод, удалось решить не все проблемы. Так, фермент рибонуклеаза, синтезированный по методу Меррнфильда, ие обладает той же биологической активностью, что и природный фермент. Возможно, наиболее серьезна проблема «пропусков», в результате чего аминокислоты могут быть пропущены или же мо-ут занять неправильное место в полипептидиой последовательности вследствие

92

Глава 2

неправильно прошедшей нли вообще не прошедшей реакции образования пептидной связи. Нарушения пептидного синтеза могут быть обусловлены вкладами различных факторов, большинство из которых имеет общую природу: при твердофазном методе реакция проходит не в гомогенной среде. Например, при образовании пептидной связи ковалентно присоединенная к носителю нуклеофильная аминогруппа полипептндной цепн может оказаться стерически блокированной полимером, ие участвуя, таким образом, в реакции со свободной карбоксильной группой до следующей стадии, когда в систему будет введена новая аминокислота со свободной карбоксильной группой. Однако другие полнпептндные цепн. ковалентно закрепленные на носителе, возможно, не окажутся блокированными в процессе реакции конденсации. Поэтому после завершения синтеза получается смесь белковых продуктов, которые можно разделить методом колоночной хроматографии. Частично решить проблему направленного синтеза удалось путем получения коротких полипептидных цепей, которые затем снимают с носителя и конденсируют в желаемый белок.

Были предложены п другие методы синтеза с использованием полимерных носителей. Хотя ни один из них не получил такого широкого признания, как метод Меррифильда, некоторые из них успешно применялись для синтеза коротких полнпептидов, например полимер, полученный алкилированием полистирола 4-окси-З-иитробеизнлхлорндом по Фриделю — Крафтсу [10]. Первая аминокислота реагирует с ДЦГК и присоединяется к носителю с образованием активного эфира. Вторая аминокислота затем реагирует с этим активным эфиром, давая пептидную связь. Полимер при этом является уходящей группой. Таким образом, в противоположность методу Меррифильда после каждой реакции конденсации продукт реакции переходит в раствор и при необходимости может быть очищен. Исключаются «пропуски»; однако каждая стадия конденсации требует повторного присоединения полипептида к полимеру.

Следует обратить внимание на сходство твердофазного метода синтеза и биологического синтеза белков. В обоих случаях аминокислота присоединена своей карбоксигруппой к обширной макромолекуляриой поверхности, на которой происходит последовательное присоединение других аминокислот и образование пептидной связи. В одном случае полимер, подобно молекуле тРНК в пептндилсвя-зывающем центре, является уходящей группой, тогда как в другом случае полимер, подобно тРНК в аминоацилсвязывающем центре, остается связанным с цепью после образования новой пептидной связи. Конечно, комплекс тРНК—рибосома имеет более сложную природу, чем полистирольная матрица.

2.7. Асимметрический синтез а-аминокислот

В процессе химической эволюции природа должна была выбрать избирательные методы синтеза аминокислот и специфического узнавания. В связи с этим интересно, какими же химическими методами синтеза аминокислот в оптически чистой форме и разделения энантиомеров владеем мы сегодня? Ниже рассмотрены два подхода к асимметрическому синтезу аминокислот с применением понятия асимметрической индукции и специфического комплексообразования с ионами металлов.

Общеизвестно, что одна из нерешенных задач органической химии — проведение эффективного асимметрического синтеза из прохирального предшественника точно так же, как это делают ферменты. Как вариант, приводящий к желаемому результату, можно использовать оптически активный реагент, который диасте-реотопно взаимодействовал бы с реагирующей молекулой и приводил к получению асимметрического продукта.

Биоорганическая химия аминокислот

93

Тот факт, что а-аминокислоты суть составляющие белков, придает им особое значение. Восемь аминокислот называют «незаменимыми», потому что млекопитающие не могут их синтезировать и должны получать вместе с пищей. Это изолейцин, лейцин, лизин, метионин, валин, треонин, фенилаланин и триптофан. Они все обладают L-конфигурацией, и располагать способом получения таких аминокислот весьма важно. Десять лет назад с этой целью использовали в основном биохимические методы, основанные на разделении рацемических смесей.

2.7.1. Метод Кори

Группа французских химиков под руководством Кагана сообщила о проведении асимметрического синтеза ь-аспарагиновой кис*10ты, причем исходным соединением послужил оптически активный аминоспирт [11]. Схема синтеза приведена на рис. 2.6.

l

Рис. 2.6. Синтез монометилового эфира L-аспарагиновой кислоты по Кагану [11].

Оптически активное ненасыщенное циклическое исходное соединение гидрировали с наименее стерически затрудненной стороны двойной связи, что приводило с очень хорошим выходом к образованию нового асимметрического атома углерода. Стерео-специфичность реакции восстановления обеспечена наличием объемного фенильного кольца в псевдоаксиальном положении. Полученный хлоргидрат монометилового эфира L-аспарагиновой

94

Глава 2

кислоты характеризовался оптической чистотой 98% *. Как недостаток этого метода отметим утрату исходного асимметрического аминоспирта, превращающегося в дифенилэтан. Кроме того, маловероятно, что этот метод окажется общим и для других а-аминокислот.

Поэтому не исчезла необходимость в более общем методе, в котором асимметрический реагент не тратился бы и который обеспечивал бы регенерацию исходных продуктов. Таким требованиям соответствовал разработанный в 1970 г. Кори с сотр. [12];

х~~\ х—

\.. . ... rcotooh v

N—Y* -> .N—Y*

H2NX 4OH N^" *\>

/С—гиЭразоно-] R xO лакгоон

H2N-CH—COOH + N—Y*

r нг XOH

Рис. 2.7. Схема синтеза по методу Кори [12]. Хира ь