пирофосфата и проводя его реакцию с иуклеознд-монофосфатом. Альтернативным путем является гидролиз цикло-карбоната обработкой водным триэтиламином. В настоящее время для синтеза аналогов АТР и GTP, модифицированных по основанию или сахарному остатку, предпочитают использовать именно имидазолидный метод. Один из примеров — синтез

133

Г лава 3

трифосфата антибиотика кордицепина (З'-дезоксиаденозина) — мощного ингибитора синтеза РНК.

Другой метод препаративного синтеза АТР разработан недавно Уайтсадсом: используется ацетилфосфат в качестве донора фосфатной группы и иммобилизованный фермент (разд. 4.7) в качестве катализатора [30]. Реакция проходит в мягких условиях (при рН, близких к нейтральной среде, и комнатной температуре) ; относительные (к субстрату) количества нерастворимого полимерного катализатора незначительны; катализатор легко удаляется (центрифугированием), а реакция проходит более специфично, чем при неэнзиматическом синтезе (например, адено-зинтетрафосфат в качестве побочного продукта не образуется). Суммарная реакция сводится к следующему:

О О _ II II/О . сн3—с-о—л | + НО^/О

Ad

ое

u

но Ън

3 фермента, рН 6,7-6,5; :СРС

3 \СН,—С—О/ + АТР

Предложена и детальная схема реакции!

2)

аденозиикпназа аденозин + АТР -*¦ AMP + ADP

AMP + АТР

адепилаткпиаза

2 ADP

аденознн + 2 АТР

3 ADP

ацетаткиназа

3) 3 ADP + 3 ацетилфосфат--> 3 АТР+ 3 ацетат

Хотя из уравнения реакции и не следует, для инициации реакции необходимо лишь небольшое количество АТР (меньше чем 1/1000 по массе), поскольку реакция поддерживается образующимся АТР. Три фермента иммобилизованы на сшитом полн-акриламндном геле путем взаимодействия их первичных аминогрупп с «активными эфирами» на поверхности полимера.

В заключение следует упомянуть о синтезе АТР, содержащем хиральный у-атом фосфора; этот синтез был проведен недавно Ноулсом [31]. Взаимодействие аденозннднфосфата АРР с фосфо-

Биоорганическая химия фосфатов

139

рилирующим агентом, меченным изотопом, привело к образованию [V-,60, 170, 180]-АТР:

17,

О С1 С1ев СНз SJ А ,СН3

УС + Нг<^СНз^^ X Vh с/ xci J 17° ^^_?ь

(-)-ЭфеЭрип

ADP

(сеобовная

СН, кислота.)/' И

сн,-Лн*17° о о

Ph^o'T^T^O^O-CH, о Ad 1вО О О Ч/ \7

в в в V

но* Ън

"он

CHj

17,

ООО

II II II

р* р0 . р«

е1б0/|\0/|\0/|\ о Ad

ооо \^ у

в18 в в \/

но^ Ън

Реакция хлороксида фосфора, меченного изотопом 170, с (—)-эфедрином приводит к реакционноспособному пятичленному циклическому соединению, атом хлора в котором с отличным выходом можно заместить при взаимодействии с |80-меченым гид-роксидом лнтня. Образуется прекрасный фосфорилирующий агент, пятичленный цикл которого напряжен и который содержит кис-лотолабильную фосфамидную связь. Бензильная связь образующегося ациклического фосфомоноэфира чувствительна к каталитическому гндрогенолизу, в результате которого образуется хиральный АТР.

140

Глава 3

Синтезированный АТР весьма полезен при изучении стерео-химических закономерностей и, следовательно, механизма реакции фосфорилнрующнх ферментов (киназ) (разд. 3.3). Можно представить по крайней мере два механизма, по которым фермент катализирует передачу у-фосфатной группы от АТР к субстрату. Это может происходить, во-первых, прямым замещением на поверхности фермента с обращением конфигурации хираль-ного у-фосфата:

О О . .

Нейтральный ° О д =

субстрат nKJ ип-

R—О—Р'™»»0

тосфорилированный субстрат

Согласно второму механизму, фермент путем взаимодействия с АТР сначала фосфорилируется, образуя переходный ковалентный ферментсубстратный интермеднат, который затем претерпевает замещение субстратом. В результате суммарного процесса конфигурация сохраняется, т. е. имеют место два процесса обращения:

О С) Ad

ферменту4

нуклеофил на поверхности фермента с

в он

.о

0--R о.

фермент'/ перехоЭный фосфорилированный. интермеЗиат субстрат

Биоорганическая химия фосфатов

141

Обращение конфигурации у хпрального у-фосфора наблюдалось в случае ферментов глнцеролкнназы, пнруваткиназы и гексокиназы [32].

3.4.2. сАМР и cGMP

основание

/ \ / основание=аЭенин sq_р > / и(Ш гуанин

\о# "ОН

Функция циклических нуклеотидов 3',5'-цнклоаденозинмоно-фосфата (сАМР) и З'.б'-цпклогуанозпнмонофосфата (cGMP) состоит в регуляции межклеточных процессов коммуникации [33]. Межклеточная коммуникация осуществляется главным образом по трем механизмам. Первый заключается в передаче электрических импульсов в нервной системе. Во втором участвуют химические медиаторы или гормоны. Третий сводится к белковому синтезу de novo. Все три процесса возникают как реакция на раздражитель, или стимул, и в их регуляции по крайней мере в некоторой степени принимают участие циклические нуклеотиды.

На любой данный процесс сАМР и cGMP оказывают противоположное действие. Так, например, если сАМР регулирует какой-то процесс, прекращая определенную реакцию синтеза, то cGMP скорее всего будет эту реакцию стимулировать. Хотя такая гипотеза («Yin — Yang»), кажется, оправдывает себя в уже изученных случаях, следует заметить, что о cGMP меньше данных, чем о сАМР. Известно, что и сАМР, и cGMP выполняют роль вторичных медиаторов в биохимическом ответе на внешний (химический) раздражитель. Классический пример — выделение в кровоток гормона адреналина при испуге. Это приводит к повышению содержания сахара в крови, что невозможно без вторичного медиатора сАМР.

Действующим началом, посредством которого циклические нуклеотиды оказывают свое влияние, является определенный класс ферментов — протеинкиназы. Как указывает название, эти ферменты катализируют фосфорилирование белковых субстратов (обычно ферментов). Каким именно образом протеинкиназы контролируют различные процессы, можно понять, вернувшись к проблеме секреции адреналина под действием страха.

Ферменты, синтезирующие сАМР и cGMP, — это аденилатциклаза и гуанилатциклаза соответственно. Ферменты включают две субъединнцы: регуляторную, к которой присоединяются эффектор (гормон, нейромедиатор) и гуанозпнтрнфосфат (GTP), ч каталитическую, на которой собственно и происходит синтез циклического нуклеотпда. Эти ферменты присоединены к клеточной мембране таким образом, что регуляторная субъединица способна

142

Глава 3

элинефрин + GTP

if -сн3

а клеточная мембрана

(с AMP) + PPj.

(с AMP)

©

протеинкиназа

+ А АТР

ОН

фосфорилаза b

+ A ADP

П Pi фосфорилаза а

/фосфорилаза\ I фосфатазы /

Рис. 3.8. Роль сАМР в качестве связующего звена между внешним раздражителем (секреция гормона) и началом физиологического ответа. Адреналин и GTP связываются с регуляторной субъединицей аденилатциклазы, специфически присоединенной к мембране. Это вызывает конформационные изменения, приводящие к активации каталитической субъединицы н стимулированию синтеза сАМР. сАМР активирует протеиикиназу, вызывая ее диссоциацию и освобождение активной каталитической субъединицы (R — регуляторная субъединнца; С — каталитическая субъединнца). Эта последняя в свою очередь катализирует фосфорилирование двух сериновых остатков неактивного фермента фосфорилазы Ь. Два димера ассоциируют с образованием активного тетрамера — фосфорилазы а. Фосфорилаза катализирует расщепление гликогена, представляющего собой способ хранения сахара, до глюкозо-1-фосфата (фосфоролпз).

связывать определенный эффектор, находящийся вне клетки, а каталитическая субъединица синтезирует циклические нуклеотиды внутри клетки (рис. 3.8). Следовательно, при испуге и выделении адреналина в кровоток этот гормон, циркулируя, может связаться с молекулой аденилатциклазы, регуляторная субъединнца которой специфически узнает данную молекулярную структуру (например, на плазматической мембране клеток печени). После того как адреналин и cGTP связываются с субъ-еднницей, происходят конформационные изменения этой субъединицы, которые передаются каталитической субъединице и вызывают на ней синтез сАМР. Эндогенный циклический нуклеотпд связывается затем с молекулой протеинкиназы. Описываемая ниже последовательность событий общая для всех процессов, кон-

Биоорганическая химия фосфатов

143

тролируемых циклическими нуклеотидами, однако здесь особое внимание уделяется частному случаю выделения адреналина. Протеинкиназы также состоят из двух субъединнц: регуляторной, связывающей молекулу сАМР, и каталитической, катализирующей фосфорилирование специфического белкового субстрата *. Однако связывание сАМР вызывает диссоциацию регуляторной и каталитической субъединиц. Вероятно, вследствие того что каталитическая субъединица обращена в водную среду, или вследствие конформационных изменений, которые влияют на ее геометрию подходящим для каталитического акта образом,— это теперь активная частица. Она будет фосфорилировать специфический белок. В этом случае фермент — это димерная частица фосфорилаза Ь, обладающая низкой ферментативной активностью. Однако после фосфорилирования протеинкиназой (для данного случая называемой фосфорилазой) димерный фермент ассоциирует в активный тетрамер — фосфорилазу а. Тетрамер катализирует расщепление гликогена, в форме которого сохраняется сахар, в мономерную глюкозу. Следовательно, в ответ на появление эпинефрнна (адреналина) уровень сахара в крови повышается. Тем не менее это происходит вследствие непрямого воздействия эпинефрнна вместо вторичного медиатора — циклического нуклеотпда.

Существует много других процессов, регулируемых циклическими нуклеотидами; их можно разделить на следующие три категории: секреция гормонов, передача нервных импульсов и белковый синтез. Например, сАМР, опять же посредством протеинкиназы, активирует фермент тирозингидроксилазу.

Реакция превращения аминокислоты тирозина в дноксифеннл-аланпн (ДОФА), катализируемая тирозингидроксилазой, является стадией, определяющей скорость биосинтеза нейромедиаторов, дофамина и норэпинефрина. Нейромедиатором называется соединение, выделяемое в точке соприкосновения двух нервных к